史文娟，王雪嬌，雷占東，蘇琬真，張翼超，焦向英

(山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030001)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指胰島素發(fā)揮作用的靶器官、靶組織，如肝臟、脂肪、骨骼肌等對胰島素的敏感性降低，導(dǎo)致這些組織對葡萄糖的攝取利用能力下降，血糖升高，機(jī)體出現(xiàn)糖代謝紊亂[1]。IR是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，是2型糖尿病的病理基礎(chǔ)[2]。肥胖是IR發(fā)生的重要風(fēng)險因素，肥胖患者大多會出現(xiàn)IR，近年來，隨著肥胖癥患病率在全球范圍內(nèi)與日劇增，2型糖尿病的發(fā)病率也在逐年上升。因而，改善肥胖癥患者的IR對于2型糖尿病的防治具有重要意義。

胰島素作用于脂肪組織，促進(jìn)脂肪組織脂質(zhì)合成。除了能量儲存，脂肪組織也是重要的內(nèi)分泌器官，在肥胖發(fā)生的過程中，脂肪組織分泌功能紊亂也會造成胰島素抵抗。此外，白色脂肪組織的胰島素信號通路也參與調(diào)節(jié)肝臟糖異生，從而影響糖代謝[3]。所以，脂肪組織IR對機(jī)體糖脂代謝有重大影響，改善脂肪組織IR對于恢復(fù)肥胖患者糖脂代謝穩(wěn)態(tài)，預(yù)防2型糖尿病有重大意義。

腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)的研究已有120多年的歷史，其經(jīng)典的生理作用是調(diào)節(jié)機(jī)體血壓和水鹽的平衡。其中，血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor, AT1R)是該系統(tǒng)發(fā)揮生物學(xué)作用的主要受體，針對該受體的阻滯類藥物(angiotensin Ⅱ type 1 receptor blockers, ARB)是臨床上經(jīng)典的降壓藥，在高血壓及心力衰竭等心血管疾病的防治中發(fā)揮重要作用。機(jī)體除了循環(huán)系統(tǒng)的RAS，各組織器官也存在局部RAS。近年來，由于與代謝紊亂密切相關(guān)，脂肪組織RAS也受到越來越廣泛的關(guān)注。動物研究顯示[4]，脂肪組織過表達(dá)血管緊張素原(angiotensinogen, AGT)可導(dǎo)致脂肪組織炎癥及胰島素抵抗。此外，臨床發(fā)現(xiàn)ARB類藥物在抵抗肥胖、胰島素抵抗及糖尿病等代謝性疾病方面也具有積極作用[5-6]。但是，由于ARB的不依賴于AT1R的PPARγ激動樣作用[7]，所以在代謝研究方面，ARB并不能完全模擬AT1R抑制的情況，導(dǎo)致AT1R在胰島素抵抗等代謝紊亂疾病方面的作用及機(jī)制尚不清楚。

因而本研究通過建立AT1aR敲除大鼠模型來探究AT1R在胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展中的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AT1aR敲除可以明顯改善高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗，這表明AT1aR可能成為改善糖尿病患者胰島素抵抗的新靶點(diǎn)，同時本研究也希望為ARB類藥物的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和材料4周齡的SPF級♂SD大鼠購于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號為：SCXK(晉)2015-0001和AT1aR基因敲除的♂SD大鼠(XM003006,南京大學(xué)-南京生物研究院)各12只。所有大鼠均喂養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)生理系SPF級動物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，溫度(25±2)℃，12 h晝夜交替，動物可自由飲水和攝食，所有動物實(shí)驗(yàn)的操作過程均符合山西醫(yī)科大學(xué)動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)過了倫理委員會批準(zhǔn)。

PCR引物(Tab 1)、總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增試劑均購于日本TaKaRa公司，；免染SDS-PAGE凝膠制備試劑購自美國Bio-Rad公司；胰島素ELISA試劑盒(CEA448Ra)購自武漢云克隆公司；山羊抗兔二抗購于武漢博士德生物工程有限公司；P-AKT(ser473)(9271S)、AKT(9272S)、IR(3025S)、Glut4及β-actin一抗均購于CST；PKCα、PKCε、PKCη、PKCβ1、PKCβ2、PKCδ一抗均購于Abcam公司。

Tab 1 Primer sequence for PCR

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動物模型的建立 4周♂SD大鼠和AT1aR基因敲除的大鼠各自隨機(jī)分為正常飲食組(normal diet group, ND)和高脂飲食組(high fat diet group，HFD)。HFD組以60%的高脂飼料(D12492，北京惠特比科技有限公司)、ND組以普通飼料喂養(yǎng)12周，成功建立肥胖模型。取雙側(cè)附睪脂肪組織，觀察脂肪組織形態(tài)。

1.2.2血清胰島素水平測定 大鼠提前禁食不禁水10 h，麻醉后進(jìn)行腹主動脈采血，獲得全血于負(fù)壓采血管內(nèi)，室溫靜置2 h后離心獲取血清標(biāo)本。按照胰島素ELISA試劑盒(CEA448Ra)的操作說明測定大鼠血清胰島素水平。

1.2.3胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)的計算 測定大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)及空腹血清胰島素水平，HOMA-IR=FBG×空腹血清胰島素/22.5。

1.2.4Western blot 取大鼠的附睪脂肪組織0.3 g，加入裂解液、PMSF、磷酸酶抑制劑(分別為100: 1: 1)，用組織研磨儀低溫勻漿。靜置1 h后12 000 r·min-1離心20 min，吸取中層清亮液體，得到脂肪組織蛋白。接著根據(jù)BCA試劑盒(凱基生物)測量蛋白濃度，統(tǒng)一各樣本每孔上樣量到25 μg。在蛋白樣本中加入裂解液和loading buffer后，置于100 ℃，5 min，使之變性，冷卻至室溫后置于-40 ℃?zhèn)溆谩＞郾０纺z電泳，隨后將蛋白由膠轉(zhuǎn)至PVDF膜。用5%的脫脂奶粉或BSA封閉3 h、TBST清洗(7 min，3次)、一抗孵育4 ℃過夜，其中P-AKT(ser473)、AKT、IR及Glut4的一抗?jié)舛葹? ∶1 000；PKCα為1 ∶5 000；PKCβ2為1 ∶1 000；PKCε、PKCη、PKCβ1、和PKCδ的抗體濃度為1 ∶2 000；β-actin為1 ∶8 000。次日，TBST清洗(7 min，3次)后加入二抗孵育3 h、TBST清洗(7 min，3次)，曝光。用ImageJ軟件分析其灰度值，并進(jìn)行統(tǒng)計。

1.2.5Real-time PCR

1.2.5.1 RNA提取及反轉(zhuǎn) 取大鼠附睪脂肪組織0.1 g，加入TRI提RNA，Nanodrop One測RNA濃度，根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明要求將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。

1.2.5.2 擴(kuò)增 根據(jù)RNA擴(kuò)增試劑盒的操作說明，利用熒光定量PCR儀(LightCycle 96SW)對所獲得的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，比較其CT值，并計算2-ΔΔCT值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，見Tab 2。

Tab 2 Gene name and primer sequence for RT-PCR

2 結(jié)果

2.1 AT1aR敲除肥胖大鼠模型建立鼠尾提取大鼠DNA，PCR鑒定基因型，如Fig 1A結(jié)果顯示，1～6均為AT1aR敲除純合子大鼠，7～12為野生型大鼠。兩種基因型大鼠各自用普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)12周后，高脂喂養(yǎng)的WT鼠的腹腔脂肪組織明顯多于普通飼料喂養(yǎng)的WT鼠。其次，高脂組WT鼠的腹腔脂肪組織也明顯多于同組AT1aR-/-鼠(Fig 1B)。完整分離雙側(cè)附睪脂肪組織，觀察其實(shí)物形態(tài)，如Fig 1C結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)的WT大鼠的附睪脂肪組織明顯大于普通飼料喂養(yǎng)的WT大鼠，且高脂組AT1aR-/-鼠的附睪脂肪組織也明顯小于同組WT鼠。

2.2 AT1aR敲除改善高脂飲食大鼠的胰島素抵抗胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)是評價機(jī)體胰島素抵抗的重要指標(biāo)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，普通飼料正常喂養(yǎng)的情況下，AT1aR-/-鼠和WT鼠的HOMA-IR無明顯差異，但是高脂喂養(yǎng)的AT1aR-/-鼠的HOMA-IR明顯低于同組WT鼠(P<0.05)(Fig 2C)。上述結(jié)果表明，AT1aR敲除可以明顯改善高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗。此外，高脂組AT1aR-/-鼠的空腹血糖也明顯低于WT鼠(P<0.05)(Fig 2A)。血清胰島素水平僅在高脂和普通喂養(yǎng)的WT鼠間有差異(P<0.05)(Fig 2B)。

2.3 AT1aR敲除改善高脂誘導(dǎo)的胰島素信號通路受損肥胖患者體內(nèi)胰島素信號通路受損，發(fā)生胰島素抵抗。脂肪組織是胰島素發(fā)揮作用的重要組織，因而通過對脂肪組織胰島素信號通路關(guān)鍵蛋白的檢測，發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)后AT1aR-/-鼠脂肪組織的胰島素受體(insulin receptor, IR)表達(dá)水平、蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)磷酸化水平以及GLUT4(glucose transporter 4, GLUT4)的表達(dá)水平均明顯高于同組WT大鼠(P<0.05)(Fig 3)，這說明AT1aR敲除可以通過增強(qiáng)胰島素信號通路蛋白的表達(dá)改善高脂引起的胰島素信號通路受損。

Fig 1 Successful construction of obesity rat model

Fig 2 AT1aR knockout improved insulin resistance induced by high-fat n=6)

Fig 3 AT1aR knockout enhanced insulin signaling

2.4 AT1aR敲除抑制脂肪組織PKC的表達(dá)眾多研究均表明蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)抑制可以改善胰島素抵抗，因而對高脂飲食的WT和AT1aR-/-鼠脂肪組織PKC各亞型的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AT1aR敲除明顯降低PKCα、PKCε、PKCη的表達(dá)(P<0.05)，而對PKCβ1、PKCβ2、PKCδ的表達(dá)無明顯影響(Fig 4)。這一結(jié)果表明，AT1aR敲除主要通過抑制PKCα、PKCε及PKCη的表達(dá)而改善IR。

2.5 AT1aR敲除促進(jìn)成脂分化在肥胖發(fā)生的過程中，促進(jìn)成脂分化可以改善胰島素抵抗。通過RT-PCR對大鼠附睪脂肪組織內(nèi)與成脂分化相關(guān)的因子進(jìn)行觀察，其中，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding protein, SREBP-1c)均是成脂分化的正向調(diào)控因子。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在高脂喂養(yǎng)的情況下，AT1aR-/-鼠脂肪組織內(nèi)PPARγ與SREBP-1c的基因表達(dá)水平均高于WT鼠(P<0.05)(Fig 5)，說明AT1aR敲除可能通過促進(jìn)脂肪組織分化來改善胰島素抵抗。

Fig 4 AT1aR knockout inhibited PKC expression

Fig 5 AT1aR knockout promoted adipogenic

3 討論

肥胖患者通常會發(fā)生胰島素抵抗，長期的胰島素抵抗使機(jī)體糖代謝紊亂，血糖升高會造成2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。因而肥胖患者IR的改善對于預(yù)防及控制2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，AT1aR敲除可以通過增強(qiáng)胰島素信號通路、抑制脂肪組織PKC的表達(dá)、促進(jìn)成脂分化明顯改善高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗，這提示AT1aR抑制對于改善2型糖尿病患者的糖代謝紊亂可能有重要作用。RAS的經(jīng)典作用是對機(jī)體水鹽平衡及血壓的調(diào)節(jié)，血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)是RAS的關(guān)鍵因子，而AT1R是Ang Ⅱ發(fā)揮生物學(xué)作用的主要受體。針對AT1R的阻斷劑即ARB類藥物已經(jīng)作為降壓藥廣泛應(yīng)用于臨床，但近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)ARB類藥物可以延緩2型糖尿病的發(fā)病進(jìn)程[9]，這與本研究的結(jié)論也具有一致性，因而本研究也有望為ARB類藥物在糖尿病等代謝疾病的臨床應(yīng)用方面提供理論支持與指導(dǎo)。

與人類不同，嚙齒類哺乳動物的AT1R由2個具有大量同源序列的基因編碼產(chǎn)生，有AT1aR和AT1bR兩種亞型[10]。其中AT1aR表達(dá)于脂肪組織、腎臟、肝臟、腎上腺、卵巢、腦、睪丸、心臟、肺臟、胎盤等大多數(shù)器官，主要參與血管的舒縮反應(yīng)，調(diào)節(jié)血壓，與人類的AT1R最具同源性。而AT1bR主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的某些區(qū)域和腎上腺組織中，與哺乳動物的饑渴反應(yīng)相關(guān)[11]。故而，本研究通過建立AT1aR基因敲除大鼠來盡可能模擬人體，探究AT1R在肥胖中的作用。

胰島素通過與細(xì)胞膜上的胰島素受體結(jié)合，激活下游的胰島素受體底物，進(jìn)而使胰島素信號通路的主要蛋白AKT磷酸化激活，最終促進(jìn)GLUT4的表達(dá)及膜轉(zhuǎn)位，從而加強(qiáng)細(xì)胞對葡萄糖的攝取，降低血糖。胰島素抵抗患者的胰島素信號通路蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞對葡萄糖的攝取作用減弱，出現(xiàn)高血糖。本研究顯示，AT1aR敲除可以明顯增強(qiáng)胰島素信號通路蛋白的表達(dá)進(jìn)而改善肥胖引起的胰島素抵抗。

AT1aR敲除改善胰島素抵抗與其抑制PKC的表達(dá)有密切關(guān)系。PKCs在細(xì)胞生長、分化方面具有重要意義[12]，主要分為3大類，分別是傳統(tǒng)型PKC (α、β1、β2和γ)、新型PKC (δ、ε、η和θ)和非典型PKC(ζ、λ/τ)。其中傳統(tǒng)型PKC和新型PKC是脂質(zhì)敏感性激酶，可使胰島素受體底物的ser307及ser302磷酸化，而抑制胰島素誘導(dǎo)的受體底物磷酸化，從而抑制胰島素信號傳導(dǎo)，產(chǎn)生胰島素抵抗[13-14]。糖尿病人群的PKC活性顯著升高，抑制PKC可以明顯改善糖尿病患者的胰島素抵抗[15]。Ang Ⅱ作用于AT1R進(jìn)而通過甘油二酯-三磷酸肌醇激活下游的PKC，因而AT1aR敲除可以通過抑制PKC的表達(dá)從而改善胰島素抵抗。

成脂分化是由前體脂肪細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞形成新的脂肪細(xì)胞的過程，PPARγ在脂肪組織內(nèi)高表達(dá)，調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化[16]，SREBP-1c與PPARγ一樣均是促進(jìn)成脂分化的因子，AT1aR敲除可以促進(jìn)這兩種因子的轉(zhuǎn)錄，這提示AT1aR敲除大鼠的成脂分化增加。有研究表明[17]，高濃度Ang Ⅱ會抑制人和動物的成脂分化，其機(jī)制可能與AT1R介導(dǎo)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2和絲裂原活化蛋白激酶通路的激活有關(guān)[18]，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果具有一致性。肥胖患者能量攝入遠(yuǎn)大于消耗，過量的能量以甘油三脂的形式儲存在脂肪組織，引起脂肪細(xì)胞肥大，而肥大的脂肪細(xì)胞功能障礙，對胰島素的敏感性降低，進(jìn)而發(fā)生胰島素抵抗。隨著成脂分化的增強(qiáng)，脂肪細(xì)胞數(shù)量增加，新的脂肪細(xì)胞產(chǎn)生，而新生的脂肪細(xì)胞對胰島素的敏感性增強(qiáng)。因而AT1aR敲除可通過促進(jìn)成脂分化，改善胰島素抵抗。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AT1aR敲除可以通過增強(qiáng)胰島素信號通路、抑制PKC的表達(dá)以及促進(jìn)脂肪組織分化改善高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗，這對2型糖尿病的預(yù)防及治療有重要意義。