劉 芳，李志敏，曹振華，何 慧，2，蘇 琦，蘇 波，3

(南華大學衡陽醫(yī)學院1.腫瘤研究所、湖南省高校腫瘤細胞與分子病理學重點實驗室，2.應用解剖與生殖醫(yī)學研究所，3.藥物藥理研究所，湖南 衡陽 421001)

X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein ，XIAP)是凋亡抑制蛋白家族主要成員，它參與腫瘤細胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等惡性表型的調(diào)控[1]。XIAP高表達與胃癌臨床進展、預后具有相關性[2]，下調(diào)XIAP表達可誘導凋亡、抑制胃癌細胞增殖和遷移侵襲能力[2-4]，提示XIAP可能是胃癌防治藥物的潛在靶點。

二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是從大蒜中提取的一種低毒、有效的抗腫瘤成分[5]，它具有抗胃癌細胞增殖、遷移和侵襲作用[6]。我們之前研究DADS處理胃癌細胞的差異蛋白質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)XIAP表達下調(diào)[7]，推測DADS抗胃癌作用機制可能與其抑制XIAP表達有關。

miR-7在胃癌中低表達，過表達miR-7抑制胃癌細胞增殖、增強化療藥物的敏感性[8]。文獻報道[9]，miR-7在膠質(zhì)母細胞瘤細胞負調(diào)控XIAP表達、促進細胞凋亡。我們用miRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)，DADS處理胃癌細胞后miR-7水平上調(diào)[10]。目前，miR-7在胃癌細胞是否靶向調(diào)節(jié)XIAP表達、DADS是否通過miR-7下調(diào)XIAP尚不清楚。

本研究觀察DADS對XIAP過表達胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，明確miR-7在胃癌細胞對XIAP的調(diào)控作用，從而闡明DADS通過miR-7下調(diào)XIAP發(fā)揮抗胃癌細胞增殖、遷移侵襲的新機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DADS(317691)購自Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒(PA115)購自北京天根生化科技有限公司；Total RNA Kit(LS1030)、熒光定量PCR試劑盒(A6001)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(E2920)為美國Promega公司產(chǎn)品；抗XIAP抗體(ab21278)購自英國Abcam公司；β-actin抗體(TA-09)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；ECL發(fā)光試劑盒(LuminataTM)購自美國Millipore公司；胎牛血清(F8245)為杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品；嘌呤霉素(A11138-02)、Lipofectamine 2000(11668-019)購自美國Invitrogen公司；RT試劑盒(K1622)購自美國Thermo 公司；Matrigel基質(zhì)膠(354230)購自美國BD公司；CCK-8試劑盒(CK04)購自日本Dojindo公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和XIAP過表達細胞株的構(gòu)建人胃癌SGC7901細胞由南華大學腫瘤研究所保存，置于5% CO2、飽和濕度的37 ℃培養(yǎng)箱，用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10% FBS)培養(yǎng)。XIAP過表達GV358慢病毒載體由上海吉凱基因公司構(gòu)建和鑒定，將其與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細胞，鑒定后提取病毒，測定病毒滴度為3 × 1011TU·L-1，放置-80 ℃凍存。24孔板接種SGC7901細胞，將病毒感染細胞，用嘌呤霉素篩選并獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，qRT-PCR和Western blot驗證XIAP表達。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖實驗組分為4組，Vector組、Vector+DADS組、XIAP組、XIAP+DADS組。將細胞接種于96孔板，每組6個重復孔，細胞分別處理24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h，測定OD450值。細胞增殖率/%=[(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.4 平板克隆形成實驗將各組細胞接種于6孔板中，200個細胞/孔，每組3個重復孔，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，待自然風干后用結(jié)晶紫染色?？寺⌒纬陕?%=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。

1.5 Western blot用細胞裂解液RIPA提取總蛋白，BCA法檢測濃度，將各組等量樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜，洗膜后加二抗孵育1 h，洗膜后加ECL發(fā)光液，X片曝光。檢測灰度值，β-actin作為內(nèi)參，計算蛋白相對表達量。

1.6 劃痕實驗將各組細胞接種六孔板，待細胞融合至80%～90%時用Tip頭劃痕，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，測量細胞遷移距離，Vector組為對照，計算相對細胞遷移率。

1.7 Transwell遷移和侵襲實驗將各組細胞懸液加入Transwell上層小室，下室加含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱24 h，用棉簽拭去小室上層膜表面細胞，4%多聚甲醛固定小室下表面細胞，0.1%結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡下隨機選擇4個高倍視野，計數(shù)遷移的細胞，計算平均值。侵襲實驗步驟與遷移實驗相同，區(qū)別是在小室上層膜表面鋪上一層Matrigel基質(zhì)膠。

1.8 雙熒光素酶報告分析miR-7過表達(pHBLV-U6-RFP-T2A-Puro-miR-7，miR-7)和miR-7敲低(pHBLV-U6-RFP-T2A-Puro-miR-7-antago，miR-7-antago)慢病毒載體由上海漢恒生物公司構(gòu)建和鑒定。XIAP 3′ UTR野生型(WT)和突變型(Mut)雙熒光素酶報告重組GV306載體由上海吉凱基因公司構(gòu)建和鑒定。將miR-7過表達載體與XIAP-WT或XIAP-Mut載體共轉(zhuǎn)染細胞，48 h后檢測螢火蟲熒光素酶活性，以海腎熒光素酶為內(nèi)參，計算相對熒光值。

1.9 qRT-PCRXIAP mRNA檢測：細胞總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄成cDNA分別按照Total RNA Kit和RT試劑盒說明書進行，采用SYBR熒光檢測試劑盒進行Real-time PCR分析。XIAP：F 5′-GTGGTGGAAAACTGAAAAATTGG-3′，R 5′-GAAAGTGTCGCCTGTGTTCTGA-3′；β-actin：F 5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，R 5′-GGGCCGGACTCGTCATAC-3′。miR-7檢測均采用德國QIAGEN公司試劑盒，miRNeasy kit (#217004)和miScript II RT kit (#218161)分別用于總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄，qPCR使用miScript SYBR Green PCR Kit(#218073)，Hs_miR-7_2 miScript Primer Assay(#MS00032116)和Hs_RNU6-2_11 miScript Primer Assay (#MS00033740)，U6作為miR-7的內(nèi)參。采用ΔΔCT方法進行相對定量分析。

2 結(jié)果

2.1 DADS下調(diào)XIAP、抑制XIAP過表達胃癌細胞增殖qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組與空載體組XIAP表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；XIAP組mRNA和蛋白水平明顯高于對照組和空載體組(P<0.05)(Fig 1A)，表明成功建立穩(wěn)定過表達XIAP細胞株。

我們之前通過蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)30 mg·L-1DADS下調(diào)胃癌細胞XIAP[7]，因此本實驗繼續(xù)采用30 mg·L-1DADS 處理SGC7901細胞。qRT-PCR和Western blot結(jié)果(Fig 1B)顯示，與Vector組比較，Vector+DADS組XIAP mRNA和蛋白表達水平明顯降低，XIAP組XIAP表達量增高(P<0.05)；與XIAP組比較，XIAP+DADS組XIAP表達減少(P<0.05)。結(jié)果表明，DADS下調(diào)SGC7901細胞XIAP表達，并且DADS抑制過表達組XIAP表達。

如Tab 1所示，與Vector組比較，用30 mg·L-1DADS處理細胞24、48、72 h后，細胞增殖率呈時間依賴性下降(P<0.01)，而XIAP組增殖率高于Vector組(P<0.05)；XIAP+DADS組增殖率低于XIAP組，但高于Vector+DADS組(P<0.05)?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果(Fig 1C)顯示，與Vector組比較，Vector+DADS組克隆形成率降低，XIAP組增加；XIAP+DADS組克隆形成率高于Vector+DADS組，低于XIAP組。結(jié)果表明，過表達XIAP促進胃癌細胞增殖，DADS抑制XIAP過表達對細胞增殖的促進作用。

Fig 1 DADS inhibited proliferation of XIAP overexpressed SGC7901 cells via downregulating XIAP expression

Tab 1 Effect of DADS on proliferation of XIAP overexpressed cells (%)

2.2 DADS對XIAP過表達胃癌細胞遷移能力的影響劃痕實驗結(jié)果顯示(Fig 2A)，與Vector組比較，Vector+DADS組細胞遷移距離減少，而XIAP組遷移距離增加(P<0.05)；與XIAP組比較，XIAP+DADS組細胞遷移距離較XIAP組減少，但高于Vector+DADS組(P<0.05)。

Transwell遷移實驗結(jié)果顯示(Fig 2B)，與Vector組比較，Vector+DADS組遷移的細胞數(shù)量減少，XIAP組遷移的細胞數(shù)增加；XIAP+DADS組遷移細胞數(shù)量較XIAP組減少，但高于Vector+DADS組。結(jié)果表明，過表達XIAP增強細胞遷移能力，而DADS降低XIAP過表達細胞的遷移能力。

2.3 DADS對XIAP過表達胃癌細胞侵襲能力的影響Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示(Fig 3)，與Vector組比較，Vector+DADS組細胞穿過Matrigel基質(zhì)膠的數(shù)量減少，XIAP組細胞數(shù)量增加；DADS處理XIAP過表達細胞后，侵襲細胞數(shù)比XIAP組少，但XIAP+DADS組侵襲細胞數(shù)高于Vector+DADS組。結(jié)果表明，過表達XIAP增強細胞侵襲能力，而DADS抑制XIAP過表達細胞的侵襲能力。

2.4 DADS通過miR-7下調(diào)胃癌細胞XIAP表達用30 mg·L-1DADS處理細胞24 h，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示(Fig 4A)，DADS上調(diào)SGC7901細胞miR-7水平(P<0.05)。利用DIANA-microT-CDS、miRBase和Targetscan 3個數(shù)據(jù)庫預測miR-7的靶基因，結(jié)果均顯示XIAP mRNA 3′ UTR存在miR-7特異性結(jié)合位點(Fig 4B)。

為了研究miR-7對XIAP 表達的調(diào)控作用，首先用qRT-PCR驗證了miR-7和miR-7-antago載體轉(zhuǎn)染細胞后分別上調(diào)和下調(diào)miR-7表達(P<0.01)(Fig 4C)。雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示(Fig 4D)，與Vector比較，過表達miR-7抑制XIAP 3′ UTR WT轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性(P<0.01)；而在XIAP 3′ UTR Mut轉(zhuǎn)染細胞，Vector與miR-7組間無顯著性差異(P>0.05)，表明XIAP 3′ UTR是miR-7的直接作用靶點。接下來分別觀察miR-7和miR-7-antago對XIAP表達的影響，如Fig 4E，F(xiàn)所示，與Vector組比較，過表達miR-7下調(diào)XIAP mRNA和蛋白水平，而miR-7-antago上調(diào)XIAP mRNA和蛋白水平(P<0.01)。上述結(jié)果表明，miR-7靶向負調(diào)控XIAP 表達，DADS可通過上調(diào)miR-7抑制XIAP表達。

Fig 2 DADS inhibited migration of XIAP overexpressed cells

Fig 3 DADS inhibited invasion of XIAP overexpressed cells

Fig 4 DADS decreased XIAP expression through upregulating miR-7

3 討論

DADS通過多靶點干預調(diào)節(jié)細胞信號通路、發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。本實驗進一步研究DADS是否通過下調(diào)XIAP發(fā)揮抗胃癌作用及其負調(diào)控XIAP的機制。

XIAP抑制凋亡蛋白caspases可導致腫瘤細胞凋亡抑制和增殖，并且它參與信號通路調(diào)節(jié)，促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[1]。β-thujaplicin下調(diào)XIAP可增強腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體誘導肺癌細胞凋亡、抑制增殖[11]。褪黑素通過下調(diào)XIAP抑制增殖、增強5-氟尿嘧啶誘導結(jié)直腸癌細胞凋亡[12]。XIAP高表達與胃癌生長具有相關性，下調(diào)XIAP可抑制胃癌細胞增殖[2]。本實驗結(jié)果顯示，過表達XIAP促進胃癌細胞增殖，DADS能下調(diào)過表達細胞XIAP、抑制細胞增殖，說明DADS可通過下調(diào)XIAP抑制胃癌細胞增殖。XIAP抑制劑embelin干預PI3K/AKT、JAK/STAT、p38、p53等信號通路抑制胃癌細胞生長[13]。我們分析，DADS下調(diào)XIAP可能發(fā)揮與embelin類似的干預信號通路作用，從而抑制胃癌細胞增殖。

XIAP表達增高與胃癌轉(zhuǎn)移和預后有關[2]；下調(diào)XIAP表達可抑制胃癌細胞遷移侵襲[4]，提示XIAP可能促進胃癌細胞獲得轉(zhuǎn)移潛能。本實驗結(jié)果顯示，XIAP過表達細胞遷移侵襲能力增強，DADS下調(diào)XIAP、抑制過表達細胞遷移侵襲，表明DADS可抑制XIAP介導的胃癌細胞遷移侵襲。XIAP介導TGFβ誘導食管癌細胞由上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(EMT)，使細胞獲得轉(zhuǎn)移潛能[14]。我們之前報道，DADS抑制TGFβ誘導的胃癌細胞EMT[15]。由此推測，DADS可能通過干預TGFβ/XIAP通路抑制EMT、降低胃癌細胞遷移侵襲能力。

miRNAs通過結(jié)合mRNA 3′ UTR調(diào)控基因表達。miR-7在胃癌中發(fā)揮抑癌分子的功能，miR-7低表達與胃癌臨床進展和預后相關，恢復miR-7表達可下調(diào)EGFR、NFκB、Raf-1等癌基因表達，抑制胃癌細胞增殖、誘導凋亡、降低轉(zhuǎn)移潛能[16-17]。我們通過miRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)，miR-7在DADS處理的胃癌細胞中上調(diào)[10]。本研究利用生物信息學網(wǎng)站預測到XIAP 3′ UTR存在miR-7結(jié)合位點，通過實驗明確了XIAP是miR-7的直接作用靶點。過表達和敲低miR-7的實驗證實miR-7在胃癌細胞靶向負調(diào)控XIAP表達。我們分析，miR-7在胃癌中低表達可能引起XIAP表達增高，導致后者促進胃癌發(fā)生發(fā)展。本實驗結(jié)果證實，DADS上調(diào)miR-7，且miR-7負調(diào)控XIAP表達，表明miR-7介導DADS下調(diào)胃癌細胞XIAP表達，DADS干預miR-7-XIAP信號軸可能是其發(fā)揮抑制胃癌細胞增殖和遷移侵襲作用的機制之一。

綜上，DADS下調(diào)XIAP可抑制胃癌細胞增殖和遷移侵襲，DADS上調(diào)miR-7可抑制XIAP表達，從而揭示DADS通過上調(diào)miR-7下調(diào)XIAP、抑制胃癌細胞增殖和遷移侵襲。然而，體外研究結(jié)果還需要體內(nèi)實驗佐證。為此，我們后續(xù)將通過動物實驗驗證miR-7負調(diào)控XIAP是否介導DADS發(fā)揮體內(nèi)抗胃癌作用。