楊 晶，劉曉妮，吳青青，翟艷鐸，杜珊珊，季 洋，邢新會(huì)，陳敬華，閆昳姝

(1.江南大學(xué)生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.清華大學(xué)化學(xué)工程系生化工程研究所工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084)

博來(lái)霉素(bleomycin，BLM)是一種廣泛用于鱗癌治療的化療藥物[1-2]，但同時(shí)具有引發(fā)肺損傷和肺纖維化的副作用。據(jù)報(bào)道，由BLM引發(fā)的肺損傷發(fā)生率高達(dá)3%～18%，以老年人或接受氧療的患者尤為顯著，并且具有高致死率的特征[3]。目前，除降低總累積劑量外，尚無(wú)有效減輕BLM導(dǎo)致肺損傷的方法[4]。

氣道上皮損傷是BLM誘導(dǎo)肺損傷過(guò)程中的首要步驟[5]。BLM與過(guò)渡金屬[Fe(II)或Cu(I)]結(jié)合，將氧分子轉(zhuǎn)換成氧自由基，使單/雙鏈DNA斷裂損傷，是BLM誘發(fā)細(xì)胞毒性的主要原因[5]。但是，作為高親水性分子，BLM如何穿過(guò)細(xì)胞膜并與細(xì)胞核結(jié)合仍未可知。硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)是一種覆蓋在細(xì)胞表面的糖蛋白結(jié)構(gòu)，是維護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性和細(xì)胞功能的重要屏障。早期的研究表明，細(xì)胞表面的HS可能參與了細(xì)胞對(duì)BLM的攝取。這是因?yàn)镠S是一類(lèi)高度硫酸化的糖胺聚糖(GAG)，帶有強(qiáng)負(fù)電荷結(jié)構(gòu)，能夠通過(guò)強(qiáng)電荷效應(yīng)與帶正電荷的BLM產(chǎn)生強(qiáng)相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞[6]。HS的喪失啟動(dòng)了趨化因子動(dòng)員、中性粒細(xì)胞跨上皮外排等多種生理功能，并直接導(dǎo)致肺組織的高通透性[7]。因此，HS可能是阻斷BLM細(xì)胞毒作用的重要靶點(diǎn)之一。在BLM誘導(dǎo)肺纖維化的C57BL/6小鼠模型中，單次注射BLM即可降低肺部細(xì)胞表面HS修飾程度；在其后長(zhǎng)達(dá)30 d內(nèi)，表面多糖層仍沒(méi)有得到有效修復(fù)[8]。

肝素是一種復(fù)雜的糖胺聚糖，是臨床上常用的抗凝劑。我們先前的研究表明，肝素和低分子量肝素均能通過(guò)保護(hù)上皮的完整性，減少BLM所致的小鼠肺損傷[9]。眾所周知，肝素的硫酸化方式、位置和豐度，與其活性密切相關(guān)[10]。但在BLM誘導(dǎo)肺損傷中，肝素類(lèi)藥物的結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系尚未闡明，更重要的是，其保護(hù)肺上皮完整性的分子機(jī)制也不清晰。又由于肝素類(lèi)化合物與HS具有極其相似的結(jié)構(gòu)，推測(cè)肝素衍生物能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合BLM分子，從而保護(hù)細(xì)胞表面HS不被損傷，進(jìn)而維持上皮細(xì)胞的完整性。為了驗(yàn)證此項(xiàng)假設(shè)，我們建立了BLM誘導(dǎo)的急性肺損傷體內(nèi)、體外模型，評(píng)價(jià)不同硫酸化方式肝素的保護(hù)作用，并探討了相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑肝素(藥劑級(jí))購(gòu)自常山生物科技公司。BLM購(gòu)自大連美倫生物制藥科技有限公司。PrimeScript RT Master Mix和SYBR PreMix Ex Taq購(gòu)自日本Takara Bio生物科技有限責(zé)任公司。乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒、Hoechst染色試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Lyso-Tracker Red、二氫乙啶(DHE)檢測(cè)試劑盒、MTT檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京碧云天生物技術(shù)有限公司。羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。MPO、c-Met/p-cMet、Akt/p-Akt單抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BTSA)購(gòu)自德國(guó)Merck公司。所有其他試劑、溶劑和化學(xué)品均為分析級(jí)。

1.2 細(xì)胞系與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人支氣管上皮細(xì)胞系(BEAS-2B)由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供。C57B6/J小鼠，SPF級(jí)，♂，6～8 w鼠齡，體質(zhì)量(20～25) g，購(gòu)自中國(guó)上海凌昌生物科技有限公司，在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性喂養(yǎng)1周之后，用于本研究中的實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用倫理，并經(jīng)江南大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：JN.No20170930b0501001)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1肝素衍生物的合成 按照參考文獻(xiàn)[11]中的方法合成不同的脫硫酸化肝素，部分步驟經(jīng)過(guò)優(yōu)化處理。首先，將肝素鈉溶解于水中(10 g，50 mL)，溶液通過(guò)Amberlite IR-120-H+離子交換樹(shù)脂進(jìn)行脫鹽化處理。用2個(gè)柱體積的水洗滌樹(shù)脂，得到的產(chǎn)物與過(guò)量吡啶進(jìn)行中和反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)透析去除多余的吡啶分子，并經(jīng)冷凍干燥處理，制備肝素吡啶鹽。

將肝素吡啶鹽(2 g)溶解于二甲基亞砜和水(25 mL，95 ∶5)混合溶液，50 ℃下孵育3 h，然后用水(25 mL)稀釋。用0.1 mol·L-1的NaOH溶液將反應(yīng)溶液pH調(diào)節(jié)至9.0左右，用ddH2O對(duì)溶液進(jìn)行透析。透析產(chǎn)物經(jīng)冷凍干燥即為N-脫硫酸化肝素。

將N-脫硫酸化肝素(1 g)在4 ℃的飽和NaHCO3溶液(10 mL)中溶解，然后滴加醋酐(625 μL)，攪拌2 h。向反應(yīng)溶液中加入飽和的NaHCO3溶液，調(diào)整溶液pH值在8～9之間。然后，加入過(guò)量鹽酸中止反應(yīng)。產(chǎn)物經(jīng)水透析、冷凍干燥得到N-乙?；嗡?N-acetylation heparin，N-AcH)。

肝素吡啶鹽(1 g)與BTSA (5 mL) 在無(wú)水吡啶(5 mL)中于80 ℃下反應(yīng)18 h，然后加入2 mL水中止反應(yīng)。反應(yīng)后的溶劑通過(guò)真空蒸餾除去。產(chǎn)物經(jīng)透析、冷凍干燥得到6-脫硫酸化肝素(6-O-Desulfated heparin，6-DeH)。

將肝素(1 g)和NaBH4(200 mg)同時(shí)溶解于NaOH(1 mol·L-1，2 mL)溶液中。在冰水浴條件下，用鹽酸溶液將混合物溶液中和至pH 7左右，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)水透析，冷凍干燥得到2-脫硫酸化肝素。

以H2O (1H，δ4.78)作為內(nèi)標(biāo)，結(jié)合400 MHz1H-NMR、600 MHz13C-NMR和HSQC等多種核磁共振譜圖對(duì)最終產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞活力測(cè)定 BEAS-2B細(xì)胞在37 ℃，5 % CO2條件下，用含10%胎牛血清+1%抗生素(100 kU·L-1青霉素+100 mg·L-1鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.3乳酸脫氫酶活性的測(cè)定 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，貼壁培養(yǎng)12 h后，同時(shí)加入不同濃度肝素及衍生物(10、50、500 mg·L-1)，以及BLM(50 mg·L-1)溶液，共同孵育6 h。吸取各處理組細(xì)胞的上清溶液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行乳酸脫氫酶活性檢測(cè)。

1.3.4細(xì)胞活力測(cè)定 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，貼壁培養(yǎng)12 h后，同時(shí)加入不同濃度肝素及衍生物(10、50、500 mg·L-1)，以及BLM(50 mg·L-1)溶液，共同孵育12 h。終止培養(yǎng)前，每孔各加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去上清液，每孔加入100 μL DMSO。用酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，并計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)存活率。細(xì)胞相對(duì)存活率/%=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.5Annexin V/PI染色 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，貼壁培養(yǎng)12 h后，同時(shí)加入等濃度肝素及衍生物(500 mg·L-1)，以及BLM(50 mg·L-1)溶液，共同孵育12 h。用無(wú)EDTA胰酶消化細(xì)胞，制成490 μL的細(xì)胞懸液。分別加入5 μL Annexin V及5 μL PI(濃度250 mg·L-1)混勻，暗處溫育10 min。用PBS溶液清洗2遍后，樣品進(jìn)行流式細(xì)胞儀(FACS Calibur流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD)分析。

1.3.6Hoechst 33258染色 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于24孔板，貼壁培養(yǎng)12 h后，同時(shí)加入等濃度肝素及衍生物(500 mg·L-1)，以及BLM(50 mg·L-1)溶液，共同孵育12 h。棄去原培養(yǎng)基，加入1 mL固定液固定10 min，棄去固定液，加入1 mL Hoechst 33258染色液染色5 min。置于激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss LSM880，德國(guó)蔡司)下觀(guān)察拍照。

1.3.7蛋白免疫印跡 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于24孔板，貼壁培養(yǎng)12 h后，同時(shí)加入等濃度肝素及衍生物(500 mg·L-1)以及BLM(50 mg·L-1)溶液，共同孵育12 h。棄去原培養(yǎng)基，采用PBS緩沖液洗滌2次，并在冰上加入適當(dāng)細(xì)胞裂解液，用刮刀收集各處理組的細(xì)胞。將細(xì)胞置于低溫環(huán)境(4 ℃)，12 000 r·min-1離心10 min。取上清液，用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度。蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠垂直電泳，后轉(zhuǎn)移到NC膜上。封閉液室溫封閉1 h后，一抗溶液在4 ℃下孵育過(guò)夜。用TBST溶液洗滌3遍，用HRP標(biāo)記的二抗溶液室溫孵育1 h。TBST經(jīng)充分洗膜后，用化學(xué)發(fā)光儀器曝光、拍照。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。條帶灰度值用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

1.3.8動(dòng)物模型制備及藥物干預(yù) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為以下兩組：(1)采用大劑量BLM單次給藥誘導(dǎo)的急性肺損傷實(shí)驗(yàn)；將C57B6/J小鼠隨機(jī)分成4組(正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、6-DeH組、N-AcH組)，每組5只。各組小鼠用Avertin (240 mg·kg-1)麻醉，d 0氣管內(nèi)注射博來(lái)霉素(2.5 g·L-1，40 μL)。藥物干預(yù)組用INQUA?NEB PLUS(德國(guó)INQUA?NEB PLUS)霧化吸入6-DeH和N-AcH (5 g·L-1，2 mL)，隔天給藥；正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予相同劑量的生理鹽水。1周后處死動(dòng)物，收取肺組織備用。(2)小劑量2次BLM給藥誘導(dǎo)肺纖維化實(shí)驗(yàn)；將C57B6/J小鼠隨機(jī)分成4組(正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、6-DeH組、N-AcH組)，每組5只。各組小鼠用Avertin (240 mg·kg-1)麻醉，d 0和d 7分別進(jìn)行氣管內(nèi)BLM注射(1.25 g·L-1，40 μL)。藥物干預(yù)組分別霧化吸入6-DeH和N-AcH(5 g·L-1，2 mL)，隔天給藥。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予相同劑量的生理鹽水。給藥2周后處死動(dòng)物，收取肺組織備用。

1.3.9羥脯氨酸測(cè)定法 將小劑量2次BLM給藥誘導(dǎo)肺纖維化組處死后，取出右側(cè)單片肺葉，稱(chēng)質(zhì)量，在110 ℃ 下烘烤24 h以徹底除去水分，并稱(chēng)質(zhì)量。樣品用NaOH溶液(2 mol·L-1，2 mL)水解1 h，所得產(chǎn)物與等體積氯胺-T溶液和Erlich試劑混合。在65 ℃條件下反應(yīng)15 min。以標(biāo)準(zhǔn)羥脯氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，在550 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算羥脯氨酸的含量。

1.3.10病理組織學(xué)觀(guān)察 將各組小鼠處死后，取左肺下葉組織，4%多聚甲醛固定，脫水、包埋、切片，HE染色和免疫組化染色，鏡下觀(guān)察病理情況。

2 結(jié)果

2.1 6-DeH減輕BLM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞損傷先前的研究已發(fā)現(xiàn)肝素通過(guò)減輕肺上皮損傷而減輕BLM所致肺損傷。為了探究肝素類(lèi)藥物結(jié)構(gòu)和活性的關(guān)系，本研究首先合成了不同脫硫酸化方式的衍生物，通過(guò)多種體外方法評(píng)價(jià)其對(duì)BLM誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，從而篩選出最有潛力的候選物。

乳酸脫氫酶(LDH)釋放是細(xì)胞通透性的可靠指標(biāo)，故首先考察各組藥物對(duì)BLM誘導(dǎo)細(xì)胞通透性的影響。Fig 1A結(jié)果表明，肝素、6-DeH和N-AcH均可減少博來(lái)霉素誘導(dǎo)乳酸脫氫酶的釋放，且6-DeH的保護(hù)作用具有劑量依賴(lài)性。MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了藥物對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)細(xì)胞活性的影響，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比(negative control，NC)相比，6-DeH可使BEAS-2B細(xì)胞的存活率提高21.3%，而N-N-AcH 組沒(méi)有顯著變化(Fig 1B)。與上述結(jié)果一致，Annexin V/PI染色顯示，6-DeH可顯著減少BLM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和壞死(50%以上，P<0.01)，而N-AcH則沒(méi)有顯著變化(Fig 1C，D)。Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，NC組細(xì)胞核為亮藍(lán)色，有新月形，并伴隨著細(xì)胞核固縮、碎裂、染色質(zhì)凝聚的現(xiàn)象，而6-DeH組細(xì)胞核形態(tài)明顯改善，趨向空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)(Fig 1E)。

2.266-DeH抑制Sydecan-1脫落和激活c-Met/AKT信號(hào)通路 為了檢測(cè)肝素衍生物是否能與吸附在細(xì)胞上的BLM產(chǎn)生相互作用，我們用不同的熒光對(duì)BLM和肝素衍生物進(jìn)行標(biāo)記，并將得到的FITC-6-DeH /FITC-肝素(綠色，50 mg·L-1)和Cy5-BLM(藍(lán)色)一起與細(xì)胞共孵育，用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察1 h和6 h的熒光分布。在NC組中，BLM能夠侵入胞質(zhì)，并伴有細(xì)胞腫脹、脫落和滲出；而6-DeH組和肝素組均可減輕細(xì)胞破壞程度，阻止BLM進(jìn)入細(xì)胞核區(qū)，證實(shí)了肝素和6-DeH具有維持上皮屏障完整性的潛力(Fig 2A)。此外，肝素、6-DeH與BLM在細(xì)胞上的位置幾乎重疊(Fig 2A)，提示肝素和6-DeH可能與BLM競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。

硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)是一組與細(xì)胞表面HS結(jié)合的蛋白質(zhì)，在肺損傷過(guò)程中會(huì)伴隨HS脫落，從而破壞了上皮細(xì)胞的完整性。在這些蛋白多糖中，Syndecan-1是維持上皮細(xì)胞功能最重要的成分之一，它通過(guò)結(jié)合細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，作為輔助受體和可溶性效應(yīng)因子發(fā)揮作用[12]。Syndecan-1的上調(diào)能夠激活c-Met/Akt通路，發(fā)出抗凋亡信號(hào)，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，減少了肺損傷作用[13]。因此，我們?cè)u(píng)價(jià)了肝素及其衍生物對(duì)Syndecan-1表達(dá)及c-Met/Akt通路激活情況的影響。Fig 2B結(jié)果顯示，肝素組和6-DeH組Syndecan-1的表達(dá)升高。此外，下游p-cMet/c-Met和pAkt/Akt(Fig 2C)的比值增加，表明c-Met/Akt通路已被激活。因此，肝素和6-DeH可減少細(xì)胞表面HS的丟失，并通過(guò)c-Met/Akt途徑維持細(xì)胞功能。

2）娘子關(guān)泉水作為陽(yáng)泉市的主要供水水源，承擔(dān)著陽(yáng)泉市區(qū)和平定縣、陽(yáng)泉郊區(qū)及沿線(xiàn)工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及生活用水，受地質(zhì)環(huán)境的影響，水質(zhì)中硫酸鹽、總硬度偏高，除礦坑水和河流污染入滲影響外，污染的巖溶水井也是造成巖溶水硫酸鹽、總硬度逐年升高的主要原因之一，必須引起足夠重視，及早進(jìn)行治理[3]。

Fig 1 The efficacy screening with heparin derivatives for protective drug candidate against BEAS-2B cell damage induced by BLM

由于BLM通過(guò)與細(xì)胞核結(jié)合而損傷細(xì)胞，故我們通過(guò)FITC-6-DeH與溶酶體指示劑Lyso-Tracker或細(xì)胞核指示劑DAPI共染色考察6-DeH在細(xì)胞內(nèi)的分布及其是否能夠阻止BLM入核。Fig 2D結(jié)果顯示，6-DeH的熒光與Lyso-Tracker部分融合，不能與DAPI重疊，表明6-DeH分布在細(xì)胞質(zhì)中，不能進(jìn)入細(xì)胞核，故推測(cè)肝素衍生物可能通過(guò)阻止BLM靠近細(xì)胞核DNA而進(jìn)一步減輕損傷。

此外，BLM能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS積累，故我們進(jìn)行了DHE染色以評(píng)估肝素衍生物對(duì)細(xì)胞的整體氧化水平的影響，結(jié)果顯示6-DeH并不能減少BLM誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS積累(Fig 2E)。

2.3 6-DeH保護(hù)BLM誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷接著，建立BLM誘導(dǎo)的急性肺損傷C57B6/J小鼠模型，進(jìn)一步驗(yàn)證6-DeH對(duì)BLM所致急性肺損傷的體內(nèi)保護(hù)作用(Fig 3A)。HE染色結(jié)果顯示，BLM灌注8 d后，小鼠肺組織出現(xiàn)明顯病理變化，肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)大量炎性癥滲出、出血；而6-DeH治療后，肺組織結(jié)構(gòu)較為清晰、基本完整、肺泡間隔稍有增寬(Fig 3B)。在Syndecan-1免疫化學(xué)染色中(Fig 3C)，我們發(fā)現(xiàn)NC組小鼠肺組織中脫落的Syndecan-1與死亡、碎裂的上皮細(xì)胞裂解物一起，大量分布在肺泡腔內(nèi)；而6-DeH組肺泡腔內(nèi)無(wú)Syndecan-1脫落。結(jié)果表明，6-DeH阻止Syndecan-1脫落，對(duì)BLM損傷有保護(hù)作用。

Fig 2 Heparin and 6-DeH competitively bind to BLM on BEARS-2B cells and prevent Syndecan-1 shedding during cell

由于中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)在肺纖維化進(jìn)展中起著重要作用，我們又考察了中性粒細(xì)胞(MPO+)浸潤(rùn)情況，結(jié)果顯示NC組小鼠肺組織有大量中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)(Fig 3D)，而6-DeH組中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)呈現(xiàn)高度集中和局部化(粉紅色突出的區(qū)域)，提示6-DeH并不能阻止中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，推測(cè)6-DeH可能不能減輕肺損傷隨后的纖維化程度。

2.4 6-DeH延緩BLM誘導(dǎo)小鼠肺纖維化為評(píng)估6-DeH對(duì)肺纖維化的作用，我們建立二次BLM誘導(dǎo)的肺纖維化模型(Fig 4A)。結(jié)果顯示，肝素衍生物組小鼠體質(zhì)量均較NC組升高(Fig 4B)，且存活率也有所提高(Fig 4C)。但6-DeH對(duì)BLM誘導(dǎo)肺指數(shù)的增加沒(méi)有影響(Fig 4D)。與先前的研究一致，HE染色顯示，僅用BLM誘導(dǎo)的小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，大量肺泡壁塌陷，肺泡間隔顯著增寬，可見(jiàn)大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)；而6-DeH組的損傷面積減少，肺組織結(jié)構(gòu)較為清晰，肺泡間隔稍有增寬(Fig 4F)。羥脯氨酸定量結(jié)果顯示，肝素衍生物組的肺膠原沉積也較NC組有所降低(約10%，P<0.05)(Fig 4E)。α-SMA免疫染色顯示，6-DeH組成纖維細(xì)胞增殖和擴(kuò)張均較模型組(NC)略有減少(Fig 4G)。因此，6-DeH能延緩纖維化的形成。

Fig 3 Evaluation of effect of 6-DeH on BLM induced pulmonary injury

Fig 4 Evaluation of effect of 6-DeH on BLM induced pulmonary fibrosis

3 討論

BLM是從輪生鏈霉菌提取的一種抗腫瘤藥物，其主要的副作用是引起成人肺損傷，隨后出現(xiàn)明顯的肺纖維化。一些研究表明，早期使用肝素可以預(yù)防BLM誘導(dǎo)的纖維化的發(fā)生[14]。然而，肝素具有強(qiáng)大抗凝血活性，這也意味著在保護(hù)肺損傷發(fā)生期間有很高的出血性風(fēng)險(xiǎn)[15]。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，肝素保持上皮細(xì)胞的完整性的機(jī)制可能與其抗凝血作用無(wú)關(guān)。因此，本研究首先進(jìn)行了系統(tǒng)的脫硫酸化反應(yīng)，得到了不同硫酸化方式的非抗凝肝素衍生物。接著，通過(guò)其對(duì)BLM誘導(dǎo)細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞活力、細(xì)胞死亡情況等方面的影響篩選出6-DeH是最有潛力的肝素衍生物。進(jìn)而對(duì)6-DeH藥效作用機(jī)制進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)6-DeH競(jìng)爭(zhēng)性地與BLM結(jié)合，減少細(xì)胞相關(guān)表面屏障分子Syndecan-1的喪失。此外，它還激活c-Met/Akt通路提高細(xì)胞存活率。最后，在BLM誘導(dǎo)急肺損傷小鼠模型上，進(jìn)一步證實(shí)6-DeH能夠降低BLM誘導(dǎo)的HS降解，保護(hù)肺上皮細(xì)胞，但其只能暫時(shí)保護(hù)肺泡的完整性，不能阻斷隨后纖維化進(jìn)程。

在急肺損傷模型中，我們發(fā)現(xiàn)6-DeH對(duì)于BLM誘導(dǎo)的肺指數(shù)增加并沒(méi)有影響，而N-AcH則表現(xiàn)出更優(yōu)的效果(Fig 4D)，提示6-DeH和N-AcH保護(hù)肺損傷作用可能是通過(guò)兩種不同的機(jī)制。已有研究報(bào)道，N-AcH通過(guò)拮抗組蛋白和靶向多種炎癥反應(yīng)來(lái)減輕急性肺損傷[16]。本研究顯示，6-DeH通過(guò)取代HS屏障與細(xì)胞表面的BLM相互作用來(lái)保護(hù)BEAS-2B細(xì)胞免受BLM的損傷。但這種差異還需更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一步證實(shí)。

此外，我們發(fā)現(xiàn)6-DeH只能延緩但不能阻斷隨后的纖維化進(jìn)程。其原因可能是HS與BLM結(jié)合是通過(guò)強(qiáng)的電荷效應(yīng)。但這種靜電相互作用是可逆的，容易被外界因素破壞，故肝素衍生物的保護(hù)作用是暫時(shí)的。因此，我們認(rèn)為6-DeH在藥物治療過(guò)程中作為輔助藥物是很有前途的。

最后，從構(gòu)效關(guān)系研究的角度來(lái)看，分子量較大、帶負(fù)電荷較多的硫酸軟骨素、硫酸皮膚素等HS模擬物可能與BLM有更強(qiáng)的相互作用。因此，這些藥物在保護(hù)肺上皮細(xì)胞免受BLM誘導(dǎo)的損傷方面可能會(huì)有更好的效果。