王 建，丁聰聰，陸 巖，李桐

廣東醫(yī)科大學(xué)廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 東莞 523808

前列腺癌是全球男性第二常見癌癥。在中國，近年來其發(fā)病率顯著上升，且確診病例中的中晚期比例明顯高于歐美發(fā)達(dá)國家，已嚴(yán)重影響到中國男性健康［1-2］。大量研究［3-6］顯示，前列腺炎癥是促進(jìn)前列腺癌發(fā)生的一個(gè)重要因素，但清晰、完整的誘發(fā)機(jī)制尚未明確。本研究旨在探究調(diào)控前列腺炎-癌轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子，這對(duì)于應(yīng)用抗炎新策略防治前列腺癌具有重要意義。

Nemo樣激酶（Nemo-like kinase，NLK）是一種與促分裂原活化激酶家族同源的較特殊的酶類，不僅以絲氨酸/蘇氨酸為靶點(diǎn)發(fā)揮激酶活性，還具有非激酶依賴的生物學(xué)功能。在不同癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中，NLK分別發(fā)揮著抑癌或促癌兩種截然相反的作用［7-8］。研究［9］發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織中NLK的表達(dá)水平顯著低于良性前列腺組織，并與前列腺癌相關(guān)的核受體相關(guān)因子1（nuclear receptor related factor 1，Nurr1）的表達(dá)水平呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，這個(gè)負(fù)相關(guān)源自NLK對(duì)Nurr1基因轉(zhuǎn)錄的負(fù)性調(diào)節(jié)，對(duì)其機(jī)制進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NLK可與核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的轉(zhuǎn)錄共激活因子CREB結(jié)合蛋白（CREB-binding protein，CBP）相互作用，抑制CBP募集到Nurr1基因啟動(dòng)子序列上的NF-κB位點(diǎn)，使NF-κB對(duì)Nurr1基因的轉(zhuǎn)錄活性顯著下調(diào)。NF-κB不但在自然免疫及炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，還是一個(gè)內(nèi)源性的促腫瘤因子，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活與前列腺癌變及惡性演變密切相關(guān)［10］。NLK是NF-κB轉(zhuǎn)錄激活的負(fù)性調(diào)控分子，其表達(dá)減少可能會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)前列腺炎癥介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化。鼠雙微體基因2（murine double minute 2，MDM2）是由NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要靶基因之一，在多種腫瘤中發(fā)生突變和擴(kuò)增，具有E3連接酶活性，介導(dǎo)P53蛋白的泛素化，以促進(jìn)其經(jīng)蛋白酶體途徑降解，且MDM2/P53被證明是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［11-12］。而NLK能以非激酶依賴方式與MDM2相互作用來限制MDM2的功能，抑制P53蛋白進(jìn)入泛素-蛋白酶體途徑，進(jìn)而減少P53的降解，以維持其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)所需的濃度［13］。由此推測(cè)NLK可能作為NF-κB和P53的共同上游調(diào)控者，影響前列腺炎-癌轉(zhuǎn)化進(jìn)程。

因此，本研究建立前列腺炎-癌轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型，并探討模型細(xì)胞中NLK對(duì)NF-κB和P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響及相互關(guān)聯(lián)方式，以明確NLK在前列腺由炎癥向癌癥轉(zhuǎn)變過程中的作用和機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器

人前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1和人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1購自漢恒生物科技（上海）有限公司，NLK基因穩(wěn)定過表達(dá)的細(xì)胞株RWPE-1（NLK↑）和NLK基因穩(wěn)定敲低的細(xì)胞株RWPE-1（NLK↓）由廣州輝駿生物科技有限公司構(gòu)建，pcDNA3.1-P53質(zhì)粒購自廣州輝駿生物科技有限公司，NF-κB-Luc質(zhì)粒購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，雙熒光檢測(cè)試劑盒購自美國Promega公司，LipofectamineTM2000、遠(yuǎn)紅外熒光標(biāo)記的二抗、Cy3標(biāo)記的二抗及FITC標(biāo)記的二抗抗均購自美國Invitrogen公司，鼠抗人Nurr1抗體、鼠抗人NLK抗體、鼠抗人MDM2抗體及兔抗人β-actin抗體均購自美國Santa Cruz公司，兔抗人P53抗體購自英國Abcam公司，胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基及K-SFM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司，免疫共沉淀試劑盒購自南京艾思易生物科技有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）試劑盒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，PCR相關(guān)引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

Odyssey成像儀購自美國LI-COR公司，GloMaxTM20/20發(fā)光檢測(cè)儀購自美國Promega公司，ABI7500 PCR儀購自美國ABI公司，激光共聚焦掃描顯微鏡（TCS SP8）購自德國Leica公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)RWPE-1細(xì)胞使用K-SFM培養(yǎng)基（添加50 ng/mL牛垂體提取物、5 ng/mL表皮生長因子和1%青霉素/鏈霉素/二性霉素B），培養(yǎng)THP-1細(xì)胞使用RPMI-1640培養(yǎng)基（添加0.05 mmol/L 2-巰基乙醇和10%胎牛血清），培養(yǎng)條件為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，平均2～3 d傳代1次。

1.3 前列腺炎-癌轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型的建立

①THP-1細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞分化：將THP-1細(xì)胞以2.5×104個(gè)/mL的濃度接種于10 cm培養(yǎng)皿中，加150 nmol/L佛波酯，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；將細(xì)胞用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）將殘留的佛波酯洗凈，加入20 ng/mL IL-4和20 ng/mL IL-13，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。② 共培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的制備：使用6孔transwell培養(yǎng)板，在下室培養(yǎng)RWPE-1細(xì)胞，初始接種量為105個(gè)/孔；在上室培養(yǎng)分化的THP-1細(xì)胞，初始接種量為4h 105個(gè)/孔，共同培養(yǎng)2 d；按上述方法培養(yǎng)多個(gè)transwell培養(yǎng)板的細(xì)胞，將下室培養(yǎng)基吸出并收集在一起，通過離心除去其中的細(xì)胞碎片，再與等量新配制的RWPE-1細(xì)胞原培養(yǎng)基混合，制成共培養(yǎng)條件培養(yǎng)基，用于將RWPE-1細(xì)胞長時(shí)間培養(yǎng)以建立細(xì)胞模型。③對(duì)照培養(yǎng)基的制備：transwell培養(yǎng)板上室只含有RPMI-1640培養(yǎng)基，不接種THP-1細(xì)胞，其他步驟同共培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的制備。④ 細(xì)胞造模：RWPE-1細(xì)胞、NLK過表達(dá)的RWPE-1（NLK↑）細(xì)胞和NLK敲低的RWPE-1（NLK↓）細(xì)胞在共培養(yǎng)條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)，2 d更換1次培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)3周后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)處理及指標(biāo)檢測(cè)。同時(shí)使用對(duì)照培養(yǎng)基培養(yǎng)的RWPE-1細(xì)胞作為空白對(duì)照。本研究實(shí)驗(yàn)分組如下：RWPE-1（NLK↑）組為RWPE-1細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NLK質(zhì)粒，RWPE-1（NLK↓）組為RWPE-1細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA-NLK質(zhì)粒，RWPE-1/THP-1組為RWPE-1細(xì)胞與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)，RWPE-1（NLK↑）/THP-1組為RWPE-1（NLK↑）細(xì)胞與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)，RWPE-1（NLK↓）/THP-1組為RWPE-1（NLK↓）細(xì)胞與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

P53表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染使用6孔板，各組細(xì)胞以2.5h 105個(gè)/孔的濃度接種到6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長至匯合度達(dá)培養(yǎng)板底70%左右時(shí)即可轉(zhuǎn)染：首先將細(xì)胞原培養(yǎng)液吸凈，用PBS洗1次，再加入新鮮的無血清培養(yǎng)基；將250 μL無血清培養(yǎng)基和5 μg目的質(zhì)?；旌霞尤氲?支離心管中，將10 μL LipofectamineTM2000和250 μL無血清培養(yǎng)基混合加入到另1支離心管中，兩管均室溫靜置5 min；將兩離心管內(nèi)容物合二為一，于室溫放置20 min；將混合物以500 μL/孔的量加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，在原條件培養(yǎng)箱中溫育4 h后，再更換為原培養(yǎng)基。雙熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染使用24孔板，所用相關(guān)試劑的量按相應(yīng)的比例減少。以上轉(zhuǎn)染過程所用試劑均不添加抗生素。

1.5 軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)

制備底層瓊脂：分別配制2h 細(xì)胞培養(yǎng)基和濃度為1.2%的瓊脂糖，兩者均以0.7 mL/孔等量混合于6孔板底部，在室溫下凝固形成底層瓊脂；制備上層瓊脂：分別配制2h 細(xì)胞培養(yǎng)基和濃度為0.6%的瓊脂糖，兩者均以0.5 mL/孔等量混合于6孔板底層瓊脂之上，同時(shí)加入濃度為1.0h 105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液100 μL，混勻，在室溫下凝固形成上層瓊脂；將細(xì)胞培養(yǎng)板置于原培養(yǎng)條件下持續(xù)培養(yǎng)14～21 d，期間每隔48 h以0.2 mL/孔的量加入細(xì)胞原培養(yǎng)基和PBS的等量比混合物，以預(yù)防干燥；將培養(yǎng)板置于顯微鏡下，以含有50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞團(tuán)作為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 MTT實(shí)驗(yàn)

各組細(xì)胞用原培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液（濃度為2.0h 104個(gè)/mL），選用96孔板進(jìn)行接種，每孔加200 μL單細(xì)胞懸液，在原培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)；分別于接種后1、2和3 d進(jìn)行如下檢測(cè)：向96孔板每孔中加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL，pH=7.4），在原培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h；除去培養(yǎng)板孔內(nèi)液體，每孔再加入150 μL二甲基亞砜，置于搖床輕度振搖約10 min；待結(jié)晶物充分溶解后用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長處的吸光度（D）值，記錄結(jié)果并根據(jù)檢測(cè)時(shí)間和D值繪制生長曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 NF-κB轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)

NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè)選用NF-κB-luc為目的基因報(bào)告質(zhì)粒，內(nèi)參為pRL-SV40質(zhì)粒。使用24孔板，各組細(xì)胞接種后同時(shí)轉(zhuǎn)染上述兩種質(zhì)粒，在原培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h；終止培養(yǎng)，除去培養(yǎng)基，并用PBS漂洗細(xì)胞；向細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔中加入0.1 mL新配制的裂解緩沖液，用移液器吸嘴反復(fù)吹洗后，置于搖床振搖30 min；取1.5 mL Eppendorf試管，加入50 μL LARⅡ及10 μL細(xì)胞裂解物，吹打混勻，用發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，此讀數(shù)為報(bào)告質(zhì)粒熒光反應(yīng)強(qiáng)度（RLU1）；將Eppendorf試管從分析儀中取出，再加入50 μL Stop &Glo?試劑，混勻后進(jìn)行檢測(cè)，此讀數(shù)為內(nèi)參照?qǐng)?bào)告質(zhì)粒熒光反應(yīng)強(qiáng)度（RLU2）；最終NF-κB轉(zhuǎn)錄活性數(shù)值以RLU1/RLU2計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 RTFQ-PCR檢測(cè)

吸出各組細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，并用預(yù)冷的PBS洗凈，向每個(gè)培養(yǎng)皿中再加入1 mL TRIzol試劑后置于冰上裂解10 min；將細(xì)胞在培養(yǎng)皿中反復(fù)吹打后吸出移至Eppendorf試管中，室溫放置2 min；加入氯仿0.2 mL，振蕩混勻，室溫放置15 min；4 ℃下12000hg離心10 min，取上層水相移至EP管，并加入0.5 mL異丙醇，混勻，室溫放置5 min；4 ℃下12000hg離心10 min，棄上清液收集沉淀，加1 mL預(yù)冷的75%乙醇溶液，溫和振蕩洗滌，真空干燥后加入20 μL經(jīng)焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理過的去離子水溶解RNA。取少量RNA測(cè)量其濃度，按照試劑盒操作說明，其余RNA取適量進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)生成cDNA，以此為模板，進(jìn)行RTFQ-PCR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)（兩步法）。所用引物序列：Nurr1基因上游為5’-TCCAACGAGGGGCTGTGCG-3’，下游為5’-CACTGTGCGCTTAAAGAAGC-3’；MDM2基因上游為5’-TTATTAAAGTCTGTTGGTGCA-3’，下游為5’-TGAAGGTTTCTCTTCCTGAAG-3’。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)

將各組細(xì)胞培養(yǎng)皿中的液體吸凈，用預(yù)冷的PBS洗3次，每皿加入1 mL放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液，置于冰上0.5 h，提取細(xì)胞總蛋白；取一部分蛋白裂解液，采用二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）法進(jìn)行蛋白定量；配制10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離膠進(jìn)行蛋白電泳（100 V，1 h），轉(zhuǎn)膜采用濕轉(zhuǎn)移法（80 V，2 h），封閉使用5%脫脂奶粉溶液（室溫，1 h）；一抗雜交（4 ℃過夜）的工作濃度：兔抗人P53抗體的稀釋比為1∶2000，鼠抗人Nurr1抗體稀釋比為1∶500，鼠抗人NLK抗體稀釋比為1∶1000，鼠抗人MDM2抗體稀釋比為1∶500，兔抗人β-actin抗體稀釋比為1∶1000；二抗雜交（37 ℃ 1 h）的工作濃度為1∶20000；用含吐溫-20磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline with Tween-20，PBST）洗膜3次，使用Odyssey雙色紅外熒光成像儀掃描成像［14］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 免疫共沉淀法

RWPE-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-P53質(zhì)粒。由于轉(zhuǎn)染了P53的細(xì)胞增殖速度減慢，本實(shí)驗(yàn)使用6孔板同時(shí)轉(zhuǎn)染6孔后，收集所有細(xì)胞再接種于10 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至細(xì)胞生長密度接近于鋪滿皿底；吸除培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞；加入1 mL預(yù)冷的RIPA裂解液，用移液器吸嘴不斷吹打，并用細(xì)胞刮刮凈皿底細(xì)胞，移至Eppendorf試管中，冰上繼續(xù)裂解15 min；4 ℃下14000hg離心15 min，取上清液移至Eppendorf試管中；將蛋白A瓊脂糖珠與PBS以1∶1的體積比混合制成工作液；向裝有蛋白提取液的Eppendorf試管中加入100 μL蛋白A瓊脂糖珠工作液，4 ℃下緩慢搖動(dòng)10 min；4 ℃下14000hg離心15 min，取上清液移至Eppendorf試管中；向Eppendorf試管中加入一抗（鼠抗人Nurr1抗體2 μg或兔抗人P53抗體1 μg），反應(yīng)總體積為0.5 mL，4 ℃下緩慢搖動(dòng)過夜；向裝有抗原抗體復(fù)合物的Eppendorf試管中加入100 μL蛋白A工作液，4 ℃下緩慢搖動(dòng)12 h；4 ℃下14000hg離心5 s，收集沉淀，用預(yù)冷的PBS洗2遍后，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)流程同1.9［14］。

1.11 細(xì)胞免疫熒光法

RWPE-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-P53后接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，貼壁生長后吸除培養(yǎng)液用PBS洗滌3次，用固定劑4%多聚甲醛溶液室溫下作用20 min；PBS洗滌3次，用透膜劑0.5%Triton X-100室溫下作用10 min；PBS洗滌3次，用封閉液5%牛血清白蛋白室溫下作用1 h；加入鼠抗人Nurr1抗體（1∶100）及兔抗人P53抗體（1∶100），4 ℃下溫育過夜；加入Cy3標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶1000）及FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶1000），37 ℃下溫育2 h，PBS洗滌3次后，使用激光共聚焦顯微鏡掃描成像［14］。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以xfs表示；兩獨(dú)立樣本間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NLK對(duì)前列腺炎-癌轉(zhuǎn)化模型細(xì)胞RWPE-1/ THP-1的增殖和轉(zhuǎn)化能力的影響

為探討NLK在前列腺炎-癌轉(zhuǎn)化中的作用，構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NLK或shRNA-NLK質(zhì)粒的RWPE-1細(xì)胞株，即RWPE-1（NLK↑）或RWPE-1（NLK↓）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與親本細(xì)胞RWPE-1組相比，RWPE-1（NLK↑）組的N L K 蛋白水平顯著上調(diào)，而RW P E-1（NLK↓）組的NLK蛋白水平顯著下調(diào)，滿足后續(xù)建立細(xì)胞模型進(jìn)行相互比較的需要（圖1A）。

MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，接種后的48及72 h，RWPE-1/THP-1組的D值顯著高于RWPE-1組（P＜0.01）；與RWPE-1/THP-1組相比，RWPE-1（NLK↑）/THP-1組的D值顯著降低，而RWPE-1（NLK↓）/THP-1組的D值顯著升高（P＜0.05，圖1B）。

集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，RWPE-1組的集落數(shù)為0，RWPE-1/THP-1組、RWPE-1（NLK↑）/THP-1組和RWPE-1（NLK↓）/THP-1組的集落數(shù)分別為（15.67f 3.05）、（5.67f 2.52）和（23.67f 2.08）個(gè)。與RWPE-1組相比，RWPE-1/THP-1組的集落數(shù)顯示從無到有的差異性。與RWPE-1/THP-1組相比，RWPE-1（NLK↑）/THP-1組的集落形成能力顯著降低，而RWPE-1（NLK↓）/THP-1組的集落形成能力顯著升高（P＜0.05，圖1C）。

圖1 NLK對(duì)模型細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化能力的影響Fig.1 Effect of NLK on the proliferation and transformation of model cells

2.2 NLK對(duì)前列腺炎-癌轉(zhuǎn)化模型細(xì)胞RWPE-1/ THP-1的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響

雙熒光素酶報(bào)告基因分析檢測(cè)結(jié)果顯示，RWPE-1組的相對(duì)活性數(shù)值為1.09f 0.37，RWPE-1/THP-1組、RWPE-1（NLK↑）/THP-1組和RWPE-1（NLK↓）/THP-1組的相對(duì)活性數(shù)值分別為13.54f 2.19、7.04f 2.04和19.94f 2.2.69（圖2）。與RWPE-1組相比，RWPE-1/THP-1組的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性明顯升高（P＜0.01）。與RWPE-1/THP-1組相比，RWPE-1（NLK↑）/THP-1組相比的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性顯著降低，而RWPE-1（NLK↓）/THP-1組的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性顯著升高（P＜0.05）。

圖2 NLK對(duì)模型細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響Fig.2 Effect of NLK on the NF-κB transcriptional activity in model cells

2.3 NLK對(duì)前列腺炎-癌轉(zhuǎn)化模型細(xì)胞RWPE-1/THP-1的Nurr1、MDM2 mRNA表達(dá)及蛋白水平的影響

RTFQ-PCR結(jié)果顯示，與RWPE-1組相比，RWPE-1/THP-1組細(xì)胞Nurr1、MDM2 mRNA表達(dá)均顯著升高（P＜0.01，圖3A）。與RWPE-1/THP-1組相比，RWPE-1（NLK↑）/THP-1組Nurr1、MDM2 mRNA表達(dá)均顯著降低，而RWPE-1（NLK↓）/THP-1組Nurr1、MDM2 mRNA表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）。

圖3 NLK對(duì)模型細(xì)胞Nurr1、MDM2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of NLK on the expression levels of Nurr1 and MDM2 mRNA and protein in model cells

Western blot結(jié)果顯示，與RWPE-1組相比，RWPE-1/THP-1組細(xì)胞Nurr1、MDM2蛋白水平均顯著升高（P＜0.01，圖3B）。與RWPE-1/THP-1組相比，RWPE-1（NLK↑）/THP-1組Nurr1、MDM2蛋白水平均顯著降低，而RWPE-1（NLK↓）/THP-1組Nurr1、MDM2蛋白水平均顯著升高（P＜0.05）。蛋白水平的變化趨勢(shì)與mRNA相同。

2.4 NLK對(duì)前列腺炎-癌轉(zhuǎn)化模型細(xì)胞RWPE-1/ THP-1中P53蛋白水平的影響

由于RWPE-1細(xì)胞中P53含量低，不利于比較NLK與P53蛋白降解的相關(guān)性，因此各組細(xì)胞檢測(cè)前48 h均轉(zhuǎn)染等量P53表達(dá)質(zhì)粒。Western blot的檢測(cè)結(jié)果顯示，與RWPE-1組相比，RWPE-1/THP-1組細(xì)胞的P53蛋白水平顯著降低（P＜0.05，圖4）。與RWPE-1/THP-1組相比，RWPE-1（NLK↑）/THP-1組的P53蛋白水平顯著升高，而RWPE-1（NLK↓）/THP-1組的P53蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。

圖4 NLK對(duì)模型細(xì)胞的P53蛋白水平的影響Fig.4 Effect of NLK on P53 protein levels in model cells

2.5 Nurr1與P53在RWPE-1細(xì)胞中的相互作用

RWPE-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染P53表達(dá)質(zhì)粒48 h后，采用免疫共沉淀法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，通過免疫共沉淀，使用抗Nurr1抗體可以捕獲P53蛋白，相反，使用抗P53抗體也能捕獲Nurr1蛋白（圖5），提示在RWPE-1細(xì)胞中Nurr1蛋白與P53蛋白之間可能存在相互作用。

圖5 Nurr1與P53在RWPE-1細(xì)胞中的相互作用Fig.5 The interaction between Nurr1 and P53 in RWPE-1 cells

2.6 Nurr1蛋白與P53蛋白在RWPE-1細(xì)胞中的表達(dá)定位

RWPE-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染P53表達(dá)質(zhì)粒48 h后實(shí)施細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)，Nurr1蛋白與P53蛋白的表達(dá)及定位情況通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，綠色熒光標(biāo)記的P53蛋白及紅色熒光標(biāo)記的Nurr1蛋白均主要分布于RWPE-1細(xì)胞核，且兩種蛋白的熒光可發(fā)生部分疊加，顯示黃色（圖6），提示Nurr1蛋白和P53蛋白可能共定位于RWPE-1細(xì)胞核內(nèi)。

圖6 Nurr1與P53蛋白在RWPE-1細(xì)胞中的表達(dá)定位Fig.6 The co-localization of Nurr1 and P53 in RWPE-1 cells

3 討論

建立前列腺炎-癌轉(zhuǎn)化模型是探討前列腺癌變機(jī)制不可或缺的研究手段。一個(gè)經(jīng)典的建模方法是先通過將正常前列腺上皮細(xì)胞與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)獲得條件培養(yǎng)基，再用該培養(yǎng)基長時(shí)間培養(yǎng)正常前列腺上皮細(xì)胞，模擬炎癥微環(huán)境，最終誘導(dǎo)其惡性轉(zhuǎn)化［15］。本研究采用RWPE-1和THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)建立了前列腺炎-癌轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型，結(jié)合NLK基因敲低或過表達(dá)，探討NLK在前列腺炎-癌轉(zhuǎn)化過程中所發(fā)揮的生物學(xué)功能。軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)等結(jié)果證明了在模擬炎癥微環(huán)境培養(yǎng)基的培養(yǎng)下，RWPE-1細(xì)胞可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，說明該前列腺炎-癌轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型的建立是成功的，并且NLK對(duì)這一惡性轉(zhuǎn)化過程發(fā)揮出顯著的抑制作用。進(jìn)一步的機(jī)制研究顯示，發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的RWPE-1細(xì)胞的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性顯著增強(qiáng)，其靶基因Nurr1和MDM2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)，同時(shí)，P53的蛋白水平相應(yīng)地降低。NLK基因的敲低可放大上述效應(yīng)，反之，NLK的過表達(dá)可抑制上述效應(yīng)。可見，NLK在炎-癌轉(zhuǎn)化過程中分別對(duì)NF-κB和P53信號(hào)發(fā)揮相反的調(diào)節(jié)作用。

關(guān)于NLK對(duì)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，已有研究證明NLK可通過干擾TAK1激酶對(duì)IKK的激活，使NF-κB蛋白的核轉(zhuǎn)位受到抑制從而導(dǎo)致活性降低［16，17］。而在本課題組之前的研究［9］中，NLK的敲低對(duì)NF-κB蛋白的核轉(zhuǎn)位僅有較弱的促進(jìn)作用，上調(diào)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性主要依賴于對(duì)CBP轉(zhuǎn)錄共激活功能的影響。這可能是由于在前列腺組織細(xì)胞中NLK蛋白大多分布在細(xì)胞核中，因而主要在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，提示在前列腺炎-癌轉(zhuǎn)化過程中，NLK是NF-κB轉(zhuǎn)錄功能激活的細(xì)胞核內(nèi)限速步驟，是防止NF-κB過度活化的重要調(diào)節(jié)分子。

MDM2作為一個(gè)癌基因，是調(diào)控P53蛋白水平的關(guān)鍵因子，且其轉(zhuǎn)錄表達(dá)受NF-κB的調(diào)控。本研究中，NLK的敲低能引起炎-癌轉(zhuǎn)化模型細(xì)胞中P53蛋白水平顯著降低而MDM2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著升高。以此推斷，NLK可能從兩方面維持P53蛋白水平：①通過抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性從而下調(diào)MDM2水平；② 直接作用于MDM2蛋白本身從而抑制其對(duì)P53的促降解作用。此外，有研究［18］表明，Nurr1可與P53蛋白第293～393位氨基酸區(qū)域結(jié)合并抑制其功能，而本研究的細(xì)胞免疫熒光及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也證實(shí)在RWPE-1細(xì)胞中Nurr1與P53蛋白存在相互作用。由此可見，在前列腺炎-癌轉(zhuǎn)化過程中，NLK還可能通過抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)Nurr1水平，進(jìn)而減輕對(duì)P53功能的抑制作用。

癌變是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，但其最基本的模式可概括為促癌因子的激活和抑癌因子的失活。在機(jī)體正常組織細(xì)胞中，兩類因子的活性及生物學(xué)影響處于一定的平衡狀態(tài)，而一旦平衡向促癌因子傾斜就容易誘發(fā)癌變。NF-κB和P53就是相互拮抗、密切聯(lián)系的兩類因子。兩者之間的相互影響在多數(shù)腫瘤的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，也是調(diào)控腫瘤發(fā)展各個(gè)階段的分子基礎(chǔ)，并參與到癌癥相關(guān)的多個(gè)重要途徑，包括腫瘤細(xì)胞代謝、促炎活性、DNA損傷、線粒體功能和ATP生成等［19-20］。通過本研究，我們對(duì)NLK影響前列腺炎-癌轉(zhuǎn)化過程可以作出這樣的解讀：促炎因子活化NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位；NLK的蛋白水平降低使入核的NF-κB轉(zhuǎn)錄功能進(jìn)一步活化；NF-κB轉(zhuǎn)錄功能活化可上調(diào)靶基因MDM2的表達(dá)，協(xié)同NLK水平的降低，導(dǎo)致MDM2的作用增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)P53蛋白降解；NF-κB轉(zhuǎn)錄功能活化還上調(diào)靶基因Nurr1的表達(dá)，Nurr1發(fā)揮競爭性抑制作用，與P53結(jié)合從而抑制其活性。概括地說，NLK的蛋白水平降低導(dǎo)致NF-κB進(jìn)一步活化，增強(qiáng)其促癌功能，并通過NF-κB/P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下調(diào)P53蛋白水平及直接結(jié)合抑制，依靠對(duì)雙方生物學(xué)作用的相反調(diào)節(jié)使“NF-κB/P53平衡”顯著地傾斜于促癌效應(yīng)，誘發(fā)前列腺癌變。

綜上所述，本研究闡述了NLK在前列腺炎-癌轉(zhuǎn)化過程中的作用及對(duì)“NF-κB/P53平衡”的“此消彼長”調(diào)控方式，為應(yīng)用抗炎新策略預(yù)防前列腺癌提供新的探索思路。下一步研究將建立前列腺炎-癌轉(zhuǎn)化動(dòng)物模型，探討NLK在活體內(nèi)的作用和機(jī)制。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。