何倍婷 林宏亮 王 盛 覃泳杰 張洪洋

翼狀胬肉作為一種常見的良性增生性眼表疾病，常表現(xiàn)為鼻側(cè)結(jié)膜和纖維血管組織呈三角形增生，當(dāng)過(guò)度生長(zhǎng)時(shí)會(huì)引起嚴(yán)重的角膜散光，甚至直接侵犯瞳孔區(qū)導(dǎo)致視力障礙。翼狀胬肉患病率高，但成因尚不明確，其治療方法以手術(shù)切除為主，只是術(shù)后復(fù)發(fā)率高。因此，研究翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制，探索可能有效的藥物治療方法，對(duì)翼狀胬肉的防治具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)，翼狀胬肉發(fā)病早期近角膜緣上皮細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，MMPs 具有溶解角膜前彈力層的作用，致使翼狀胬肉上皮細(xì)胞(PECs)向角膜移行和侵蝕[1-2]。因此，如何抑制PECs的增殖，促使其凋亡，是治療翼狀胬肉的關(guān)鍵。我們?cè)缙谘芯堪l(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)激素釋放激素受體(GHRH-R)在翼狀胬肉上皮組織中異常高表達(dá)，提示GHRH-R是PECs增殖和侵襲的潛在重要因素[1-2]。本研究通過(guò)使用GHRH-R拮抗劑MIA602進(jìn)一步探索GHRH-R對(duì)翼狀胬肉生長(zhǎng)的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco,美國(guó))，MIA602(AVS實(shí)驗(yàn)室提供，美國(guó))，單克隆抗體GHRH-R(ab76263)、Caspase-3(ab32042)、p-ERK1/2(ab201015)(Abcam,美國(guó))，內(nèi)參GAPDH(#8884,CST,美國(guó))，F(xiàn)ITC標(biāo)記IgG熒光二抗(Cambridge,美國(guó))，DAPI染料(含封片劑)(Sigma,美國(guó))。熒光倒置顯微鏡(蔡司，德國(guó))，直流穩(wěn)壓電泳儀(Bio-Rad,美國(guó))。

1.1.2 樣本取材結(jié)膜下人Tenon囊組織取自2019年7月至2021年6月于廣東省人民醫(yī)院眼科行翼狀胬肉切除手術(shù)的24例原發(fā)性翼狀胬肉患者(男10例，女14例)，所有患者術(shù)前均由專業(yè)眼科醫(yī)生進(jìn)行檢查，參照文獻(xiàn)[3]，根據(jù)翼狀胬肉組織的透明度(T1～T3級(jí))和血管化程度(V1～V3級(jí))將翼狀胬肉分為靜止期翼狀胬肉(8例)和活動(dòng)期翼狀胬肉(16例)。正常結(jié)膜組的結(jié)膜組織取自于6例結(jié)膜松弛癥患者的術(shù)中。本研究符合《赫爾辛基宣言》原則，已通過(guò)廣東省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：2019-406H-01)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 組織體外培養(yǎng)、干預(yù)及分組術(shù)中獲取翼狀胬肉頭部組織和正常結(jié)膜組織，PBS反復(fù)沖洗，剪除上皮下結(jié)締組織，將整塊上皮組織鋪于60 mm培養(yǎng)皿，等待30 min，待組織塊貼牢后加入完全培養(yǎng)基(DEME/F12培養(yǎng)液，含100 U·mL-1雙抗和體積分?jǐn)?shù)10%澳洲胎牛血清)，培養(yǎng)第3天時(shí)隨機(jī)選取8例活動(dòng)期翼狀胬肉組織使用含10 μmol·L-1MIA602的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。根據(jù)翼狀胬肉類型和培養(yǎng)條件分為正常結(jié)膜組、靜止期翼狀胬肉組、活動(dòng)期翼狀胬肉組和MIA602干預(yù)組。各組培養(yǎng)皿均置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天于鏡下觀察翼狀胬肉上皮細(xì)胞和結(jié)膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，并記錄細(xì)胞從組織塊邊緣起的最遠(yuǎn)生長(zhǎng)距離。培養(yǎng)第5天收集組織塊及細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)培養(yǎng)第5天收集組織塊及細(xì)胞，冷PBS清洗，加入RIPA裂解液提取蛋白質(zhì)，BCA法進(jìn)行定量并配平各組蛋白濃度，振蕩混勻，98 ℃蛋白變性8 min。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電泳、電轉(zhuǎn)后，蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫封閉1 h，分別使用GHRH-R(11000)、p-ERK1/2(11000)、Caspase-3(12000)和內(nèi)參GAPDH(11000)一抗孵育，4 ℃過(guò)夜。第2天，4 ℃二抗孵育2 h，使用ECL系統(tǒng)顯色，所得條帶采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度定量，計(jì)算蛋白相對(duì)GAPDH的表達(dá)水平。

1.2.3 免疫熒光染色檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)培養(yǎng)第5天時(shí)取出培養(yǎng)皿，輕輕夾去組織塊并吸除舊培養(yǎng)液，PBS清洗，40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，體積分?jǐn)?shù)0.2% Triton X-100穿透5 min，體積分?jǐn)?shù)5%山羊血清封閉20～30 min，滴加一抗GHRH-R(11000)、p-ERK1/2(11000)、Caspase-3(12000)，4 ℃過(guò)夜。PBS浸洗后，滴加熒光二抗(1500)，常溫下孵育1 h，DAPI染核，封閉，干燥，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 一般情況靜止期翼狀胬肉組織較薄，裂隙燈下可清晰見到體部覆蓋的鞏膜外層血管，輕度的血管化，向角膜侵襲進(jìn)展緩慢；活動(dòng)期翼狀胬肉組織較厚，裂隙燈下難以觀察到體部覆蓋的鞏膜血管，且血管化嚴(yán)重，可見充盈的大血管爬行，向角膜侵襲進(jìn)展較快。正常結(jié)膜組、靜止期翼狀胬肉組和活動(dòng)期翼狀胬肉組患者間性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表1)。

表1 各組翼狀胬肉分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及患者一般資料

2.2 各組上皮細(xì)胞的增殖情況組織貼壁培養(yǎng)第2天，可見柱狀上皮樣細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，密集排列，并隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，逐漸向外生長(zhǎng)移行。每天測(cè)量細(xì)胞至組織塊邊緣的最大距離，并進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，培養(yǎng)第5天，各組間上皮細(xì)胞最大生長(zhǎng)距離的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但正常結(jié)膜組和靜止期翼狀胬肉組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與正常結(jié)膜組、靜止期翼狀胬肉組比較，活動(dòng)期翼狀胬肉組PECs最大生長(zhǎng)距離顯著增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1，表2)。

圖1 光鏡下培養(yǎng)第5天各組上皮細(xì)胞最大生長(zhǎng)距離(箭頭示最遠(yuǎn)生長(zhǎng)處)

表2 各組上皮細(xì)胞最大生長(zhǎng)距離的比較

2.3 各組上皮組織中GHRH-R、p-ERK1/2和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)情況免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，正常結(jié)膜組、靜止期翼狀胬肉組和活動(dòng)期翼狀胬肉組上皮組織中GHRH-R、p-EKR1/2和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量多組間比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。與正常結(jié)膜組和靜止期翼狀胬肉組比較，活動(dòng)期翼狀胬肉組上皮組織中GHRH-R、p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量則明顯減少(均為P<0.05)。靜止期翼狀胬肉組與正常結(jié)膜組相比，雖然GHRH-R蛋白相對(duì)表達(dá)量較高(P<0.05)，但是p-ERK1/2和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量?jī)山M間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(圖2)。

圖2 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組上皮組織中GHRH-R、Caspase-3和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)情況 與正常結(jié)膜組相比，aP<0.05；與靜止期翼狀胬肉組相比，bP<0.05。

2.4 阻斷GHRH-R后各組p-ERK1/2和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)情況培養(yǎng)第5天鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，MIA602干預(yù)組PECs的增殖和移行速度明顯趨于停滯，而未干預(yù)的活動(dòng)期翼狀胬肉組PECs則表現(xiàn)為繼續(xù)快速向外生長(zhǎng)延伸(圖3)。 取兩組PECs做免疫熒光染色，結(jié)果顯示，與活動(dòng)期翼狀胬肉組相比，MIA602干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2綠色熒光亮度減弱，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，而Caspase-3紅色熒光亮度增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加(圖3)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，與活動(dòng)期翼狀胬肉組比較，MIA602干預(yù)組中GHRH-R和p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯減少，而Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增加(均為P<0.05)(圖4)。上述結(jié)果表明，阻斷GHRH-R能夠有效降低p-ERK1/2的表達(dá)并促進(jìn)Caspase-3表達(dá)，從而抑制PECs的增殖和遷移。

圖3 免疫熒光染色觀察MIA602干預(yù)后Caspase-3和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)情況

圖4 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)活動(dòng)期翼狀胬肉組和MIA602干預(yù)組中GHRH-R、Caspase-3和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)情況 與活動(dòng)期翼狀胬肉組相比，aP<0.05。

3 討論

翼狀胬肉的發(fā)生與進(jìn)展被認(rèn)為與環(huán)境變化密切相關(guān)，尤其是紫外線、干燥、粉塵等因素[4]。不利的環(huán)境因素會(huì)持續(xù)刺激眼表分泌各類炎癥因子，如白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、腫瘤生長(zhǎng)因子-β1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等，持續(xù)的炎癥反應(yīng)破壞了角膜緣干細(xì)胞，導(dǎo)致結(jié)膜上皮細(xì)胞向角膜侵蝕，形成翼狀胬肉[5-6]。關(guān)于翼狀胬肉的嚴(yán)重程度，傳統(tǒng)的文獻(xiàn)多根據(jù)翼狀胬肉體部的厚度或透明度來(lái)分期，雖然可以直觀反映翼狀胬肉的大小及纖維化程度，但是卻很難反映翼狀胬肉的侵襲性。因此，臨床上結(jié)合血管化程度，將原發(fā)性翼狀胬肉分為靜止期和活動(dòng)期，更充分地體現(xiàn)翼狀胬肉的增殖和侵襲速度[3]。本研究結(jié)果顯示，相較于靜止期，典型的活動(dòng)期翼狀胬肉多表現(xiàn)為頭部突起，頸部寬大，角膜侵蝕較深，表面血管明顯充盈等。在組織培養(yǎng)中也顯示，活動(dòng)期翼狀胬肉組中PECs的增殖和遷移速度顯著快于靜止期翼狀胬肉組，而靜止期翼狀胬肉組中PECs的增殖和遷移速度則與正常結(jié)膜無(wú)明顯差別。這說(shuō)明早期治療時(shí)將翼狀胬肉控制在靜止期是避免患者視力損害和手術(shù)治療的重要方式。

炎癥反應(yīng)在翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥環(huán)境下，PECs能夠激發(fā)出類似干細(xì)胞的特性，并分泌MMPs和MMPs抑制劑，分解細(xì)胞外基質(zhì)，促使細(xì)胞增殖和遷移。但是MMPs及其抑制劑很少表達(dá)于翼狀胬肉成纖維細(xì)胞或正常結(jié)膜上皮細(xì)胞[7]。因此，尋找PECs接受炎癥信號(hào)的媒介，抑制炎癥反應(yīng)對(duì)PECs的持續(xù)激活，是治療翼狀胬肉的重要途徑。本課題組早期研究從14例翼狀胬肉患者的翼狀胬肉上皮組織中檢測(cè)到高表達(dá)的GHRH-R蛋白[8]。GHRH-R被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的重要受體，尤其是關(guān)于腫瘤細(xì)胞的研究[9]。為了進(jìn)一步確認(rèn)GHRH-R在翼狀胬肉進(jìn)展中的作用及機(jī)制，本研究將翼狀胬肉分期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與正常結(jié)膜組、靜止期翼狀胬肉組比較，活動(dòng)期翼狀胬肉組中GHRH-R和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平均升高，Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低。靜止期翼狀胬肉組GHRH-R蛋白表達(dá)雖然也有一定程度的增加，但p-ERK1/2和Caspase-3蛋白的表達(dá)與正常結(jié)膜組無(wú)明顯差別。這提示活動(dòng)期翼狀胬肉GHRH-R蛋白顯著高表達(dá)，促使PECs增殖，同時(shí)抑制其凋亡，從而使翼狀胬肉具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)和侵襲能力。

GHRH-R蛋白在生物體內(nèi)可以調(diào)控胰島β細(xì)胞的存活[9]，以及促進(jìn)心臟保護(hù)[10]和傷口愈合[11]，該作用與GHRH相關(guān)激酶的激活有關(guān)，包括MAPKs、ERK1/2和Caspase-3[12]。ERK1/2是MAPK通路的關(guān)鍵組成部分，ERK1/2磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞核激酶，調(diào)控基因進(jìn)入復(fù)制周期，促使細(xì)胞增殖[13-14]。Caspase-3則是細(xì)胞殺傷機(jī)制中的重要組成部分，通過(guò)剪切DNA參與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)[14-15]。為了確認(rèn)GHRH-R是否通過(guò)介導(dǎo)ERK1/2和Caspase-3影響PECs，本研究使用GHRH-R拮抗劑MIA602干預(yù)活動(dòng)期翼狀胬肉，結(jié)果顯示，GHRH-R蛋白被MIA602阻斷后，p-ERK1/2的表達(dá)明顯下降，而Caspase-3的表達(dá)則顯著增加，PECs的增殖速度明顯減緩，并且出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。因此，阻斷GHRH-R可有效地抑制ERK1/2活化和促進(jìn)Caspase-3表達(dá)，從而抑制活動(dòng)期翼狀胬肉PECs的生存和增殖。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，GHRH-R在翼狀胬肉的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，尤其是在活動(dòng)期翼狀胬肉，其機(jī)制可能是GHRH-R通過(guò)激活ERK1/2和抑制Caspase-3表達(dá)促使PECs的生存和增殖，阻斷GHRH-R可有效地調(diào)控PECs的增殖和凋亡，從而抑制翼狀胬肉生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可為臨床翼狀胬肉的早期預(yù)防和治療提供新的研究方向和治療靶點(diǎn)。

致謝：感謝香港中文大學(xué)彭智培教授和朱偉杰教授對(duì)本研究提供的針對(duì)性意見和修正。