郝昕蕾 金 瑋 王文俊 齊 奇 楊安懷

眼部感染性疾病是世界范圍內(nèi)致盲性眼病的最重要原因。然而，病原體的多樣性給眼部感染性疾病的病因診斷帶來挑戰(zhàn)[1-2]。目前，臨床中病原體培養(yǎng)技術(shù)陽性檢出率低，且分子診斷技術(shù)僅能針對部分已明確的病原體[2-3]。為確定眼內(nèi)微生物感染的種類，提高病原體檢出率，需要更靈敏、無偏倚、全面的診斷技術(shù)。隨著宏基因組測序(mNGS)技術(shù)和微量樣本技術(shù)的發(fā)展[4-5]，眼科微量樣本可提供核酸、抗體、細(xì)胞、細(xì)胞因子等多項(xiàng)信息[6-9]，這使得眼內(nèi)液的臨床診斷價值大大升高[4-10]。本文就眼內(nèi)液檢測在眼部感染性疾病中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 病原學(xué)檢測

病原微生物的檢測方法多種多樣，從傳統(tǒng)的病原體培養(yǎng)到分子診斷技術(shù)，如PCR、實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)、多重固相條帶PCR(strip PCR)、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增等，以及當(dāng)下最火的高通量測序技術(shù)[1-2,11-13]，其間經(jīng)歷了不斷革新。

1.1 病原體培養(yǎng)傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)技術(shù)陽性檢出率低，不同文獻(xiàn)報道的陽性檢出率不同，基本在40%～70%[1-2,14-15]。有文獻(xiàn)報道，玻璃體液病原體培養(yǎng)陽性檢出率高于房水[1,16]，但在繼發(fā)于角膜感染的眼內(nèi)炎患者中，房水受累明顯，陽性檢出率高于玻璃體液[1]。病原體培養(yǎng)僅適用于部分微生物，如細(xì)菌和真菌，耗費(fèi)時間長，在臨床應(yīng)用中明顯受限[3,16]。與其他檢測方法相比，病原體培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于其可以進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[17]，對于調(diào)整臨床用藥具有指導(dǎo)意義。

1.2 分子診斷技術(shù)PCR作為最早使用的分子診斷技術(shù)，是大多數(shù)DNA檢測手段的基石[14]。RT-PCR能夠定量分析病原微生物，區(qū)分真實(shí)感染和外源性污染，并可預(yù)測預(yù)后[16]。16S PCR以一組能識別所有細(xì)菌中均存在的保守16S核糖體DNA作為引物，明確細(xì)菌的存在[15,18]。研究發(fā)現(xiàn)，相比于傳統(tǒng)的培養(yǎng)手段，16S PCR具有較高的靈敏度和特異度[15,17]；靈敏度過高可能造成假陽性，可檢出的微生物僅限于細(xì)菌，對真菌、病毒等無效，臨床應(yīng)用受限[15]。類似地，利用核糖體18S/28S DNA序列能確證真菌的存在[1]。strip PCR將多種病原體組成固定組合，可同時檢測多種病原微生物。有研究表明，與RT-PCR相比，strip PCR具有更高的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值，這兩種方法的檢測結(jié)果與臨床診斷結(jié)果具有較高的一致性[12,19]。strip PCR操作簡單，需要更少的樣本、時間以及金錢。但strip PCR屬于半定量檢測，無法像RT-PCR一樣提供具體數(shù)值；由于DNA擴(kuò)增干擾，如果某一病原體拷貝數(shù)較高，會影響其他病原體的檢出[12]。環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增是由Notomi等[20]首先提出的核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)避免了DNA模板初始的熱變性階段和擴(kuò)增中反復(fù)升降溫步驟，操作簡單，耗時短，但引物設(shè)計難度大，污染導(dǎo)致的假陽性會限制該技術(shù)的使用[21]。

1.3 mNGS近年來，mNGS發(fā)展迅速，美國FDA在2016年發(fā)布了二代測序體外診斷的指南草案，指出mNGS不僅可以鑒定病原微生物，也能檢出基因突變和耐藥基因等。在2020年初爆發(fā)的新型冠狀病毒疫情防控中，mNGS也發(fā)揮了重要作用。近期我國學(xué)者發(fā)布多篇有關(guān)mNGS的專家共識[22-23]。mNGS是對一代測序即Sanger測序技術(shù)的革命性變革，無需克隆即可在一次運(yùn)行中生成和檢測數(shù)百萬個核酸序列，利用mNGS高通量特性，可以獲取標(biāo)本中人源核酸序列和外源性病原微生物核酸序列信息，與人類和病原微生物基因組序列庫對比，能夠鑒定出病原體[2-3,10,24]。二代測序平臺眾多[3,24]，不同平臺檢測流程類似：樣本的提取、運(yùn)輸與處理，提取核酸與建立文庫，自動測序，質(zhì)量控制與生物信息學(xué)分析，結(jié)果解讀與報告出具[24-25]。mNGS是一種無偏倚、無假設(shè)的病原體鑒定技術(shù)，可以獲得有關(guān)物種、血清型、毒力特性和抗生素耐藥性、疾病暴發(fā)等信息，具有快速、覆蓋度廣等特點(diǎn)[8,10,22-26]。mNGS作為一種新技術(shù)，尚缺乏結(jié)果解讀統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，在數(shù)據(jù)解釋方面仍需進(jìn)一步探索和規(guī)范[22,25,27]。操作中任何污染導(dǎo)致的假陽性都會使結(jié)果分析變得復(fù)雜，檢測成本增高，限制了mNGS的臨床應(yīng)用[24-25,28]。

研究證實(shí)，mNGS在眼部感染性疾病中能夠同時檢出兩種以上病原體和未知致病微生物[15,29-30]。Lee等[15]利用mNGS檢測所有細(xì)菌培養(yǎng)陰性和部分培養(yǎng)陽性的眼內(nèi)炎患者標(biāo)本時發(fā)現(xiàn)了Torque Teno病毒，并被RT-PCR所證實(shí)。在一項(xiàng)臨床研究中，印度學(xué)者檢測了34例眼內(nèi)炎患者標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，病原體培養(yǎng)陽性15例，mNGS檢出陽性30例，他們認(rèn)為mNGS是感染性眼內(nèi)炎有價值的檢測手段[8]。Gonzales等[31]利用mNGS檢測眼部淋巴瘤患者標(biāo)本發(fā)現(xiàn)了合并HHV-4和HHV-8感染的病例。

1.4 抗體和Goldmann-Witmer系數(shù)/Witmer-Desmonts系數(shù)在診斷感染性眼病中，我們還需關(guān)注Goldmann-Witmer系數(shù)(GWC)或Witmer-Desmonts系數(shù)(WDC)的作用[13,32-33]。這些參數(shù)主要用于區(qū)別特異性抗體是眼內(nèi)原位產(chǎn)生還是血-眼屏障破壞滲漏導(dǎo)致的假陽性[4,34]。數(shù)值越高，越支持病原體IgG在眼內(nèi)原位產(chǎn)生，反之則支持滲漏所致[4,35]。這些參數(shù)使用的前提條件是眼內(nèi)液中病原體IgG為陽性[34]。計算公式如下：GWC=(眼內(nèi)液某種特定IgG濃度/血清某種特定IgG濃度)/(眼內(nèi)總IgG濃度/血清總IgG濃度)[35]；WDC=(眼內(nèi)液某種特定IgG濃度/血清某種特定IgG濃度)/(眼內(nèi)總白蛋白濃度/血清總白蛋白濃度)[13]。

以往研究報道，血清特異性IgG、IgE、嗜酸性粒細(xì)胞等對眼弓蛔蟲病的檢出率較低[36]。引入GWC后，在72例臨床診斷為眼弓蛔蟲病的病例中60例(60/72，83.33%)患者眼內(nèi)液樣本的GWC為陽性，檢出率明顯升高，眼內(nèi)非特異性IgE還可以作為GWC的補(bǔ)充指標(biāo)[35]；該研究還指出，雖然玻璃體液GWC陽性率(80.00%)稍高于房水(78.85%)，但差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。GWC不僅可以檢出眼內(nèi)寄生蟲，也可檢出病毒。Wang等[13]采集31例前葡萄膜炎并發(fā)繼發(fā)性青光眼患者的房水，發(fā)現(xiàn)WDC聯(lián)合抗體檢出了19例常見病毒感染，敏感性較高。Kang等[7]對32例病毒相關(guān)的Fuchs葡萄膜炎綜合征(FUS)患者房水進(jìn)行分析，證實(shí)所有患者眼內(nèi)液中相應(yīng)病毒的IgG抗體和GWC均為陽性，無關(guān)病毒GWC為陰性。

1.5 細(xì)胞正常情況下，房水中不含細(xì)胞成分，成年人玻璃體除皮質(zhì)層含有少量細(xì)胞外，基本不含細(xì)胞。當(dāng)眼部發(fā)生炎癥反應(yīng)時，眼內(nèi)液中出現(xiàn)不同種類的細(xì)胞浸潤，借助流式細(xì)胞術(shù)等細(xì)胞檢測技術(shù)，可以得到眼內(nèi)液細(xì)胞譜[37]，推測眼部感染可能的病原體種類。

研究發(fā)現(xiàn)，前房炎癥反應(yīng)的臨床評分與房水中細(xì)胞計數(shù)之間存在相關(guān)性，而玻璃體混濁程度與玻璃體液細(xì)胞數(shù)之間并無相關(guān)關(guān)系[37-38]。他們推測后者出現(xiàn)的原因是玻璃體混濁的嚴(yán)重程度與玻璃體液中細(xì)胞數(shù)和蛋白濃度均相關(guān)[37]。急性視網(wǎng)膜壞死患者玻璃體液中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)較高[39]。細(xì)菌性或真菌性眼內(nèi)炎患者的眼內(nèi)液中，中性粒細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)多于其他細(xì)胞，其他類型葡萄膜炎患者中T細(xì)胞升高明顯,不同細(xì)胞譜可作為不同種類病原體的線索指標(biāo)[37]。Carreo等[37]檢測了31份眼內(nèi)液樣本，發(fā)現(xiàn)在14份玻璃體液樣本中，感染性葡萄膜炎患者的CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值高于非感染性眼病患者，而17份房水樣本未發(fā)現(xiàn)該規(guī)律。上述結(jié)論與一項(xiàng)多中心前瞻性研究結(jié)果相矛盾，后者發(fā)現(xiàn)眼結(jié)節(jié)病患者CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值和CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)顯著高于眼部病毒感染患者，病毒感染患者的CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)高于眼結(jié)節(jié)病患者[39]。

2 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子是一類具有廣泛生物活性的小分子蛋白質(zhì)，能介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用，分為白細(xì)胞介素(IL)、干擾素、腫瘤壞死因子(TNF)、趨化因子、生長因子等。在眼部感染性疾病中，細(xì)胞因子能幫助我們評估眼內(nèi)炎性環(huán)境，提示治療終點(diǎn)和預(yù)測預(yù)后等。

2.1 評估眼內(nèi)炎性環(huán)境眼部感染發(fā)生炎癥反應(yīng)時，眼內(nèi)液中與炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子明顯增加，利用這一特性，可以對眼部炎性環(huán)境進(jìn)行評估。有學(xué)者對32例風(fēng)疹病毒和巨細(xì)胞病毒相關(guān)FUS患者的房水細(xì)胞因子進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與單純白內(nèi)障患者相比，F(xiàn)US患者房水中IL-6、IL-8、IL-10、血管細(xì)胞黏附分子等細(xì)胞因子含量顯著高于對照組，與前房炎癥反應(yīng)程度具有一致性[7]。Wang等[6]對38例眼弓蛔蟲病患者眼內(nèi)液進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，炎癥細(xì)胞因子,如IL-6、IL-8、IL-10、血管細(xì)胞黏附分子和VEGF含量高于健康眼。感染性眼病患者眼內(nèi)液中細(xì)胞因子含量不僅高于正常對照組，與非感染性疾病相比亦有差別。研究發(fā)現(xiàn)，眼內(nèi)炎患者眼內(nèi)液中IL-6含量高于非感染性葡萄膜炎和淋巴瘤[40]。此外，在巨細(xì)胞病毒性視網(wǎng)膜炎(CMVR)患者房水中CMV-DNA濃度與IL-6、IL-8兩種細(xì)胞因子含量顯著相關(guān)，玻璃體內(nèi)注射抗病毒藥物后，CMV-DNA載量、IL-8、IL-10含量顯著下降，以IL-8降低最為明顯[41]。

2.2 提示治療終點(diǎn)與預(yù)測預(yù)后對于病毒性視網(wǎng)膜炎或眼內(nèi)炎患者，局部治療多采用玻璃體內(nèi)注藥，何時停止注藥目前尚無共識。已有研究證實(shí)，細(xì)胞因子IL-8對骨髓造血干細(xì)胞移植術(shù)后發(fā)生CMVR患者的治療終點(diǎn)有提示作用。有學(xué)者對24例造血干細(xì)胞移植術(shù)后CMVR患者進(jìn)行前瞻性隨機(jī)對照研究，根據(jù)治療終點(diǎn)不同分為兩組，證實(shí)以房水CMV-DNA<1×106copies·L-1或IL-8<30×103pg·L-1為治療終點(diǎn)安全且有效，能減少球內(nèi)注藥次數(shù)[42]。另有研究結(jié)果表明，在HIV陰性的CMVR患者中，盡管停止治療時CMV-DNA為陽性，但以IL-8<30×103pg·L-1作為治療終點(diǎn)的患者無一復(fù)發(fā)，而所有復(fù)發(fā)患者均是以每升CMV-DNA<1×106copies·L-1為評估指標(biāo)[43]。

細(xì)胞因子對眼部感染性疾病預(yù)后亦有提示作用。在CMVR的治療過程中，IL-8降低是CMVR恢復(fù)良好的實(shí)驗(yàn)室定量指標(biāo)[41,43]；此外，Wang等[6]發(fā)現(xiàn)眼弓蛔蟲病患者前房炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重，復(fù)發(fā)的可能性越高。

3 未來與展望

3.1 病原體耐藥性研究發(fā)現(xiàn)，mNGS不僅可以檢出病原微生物，還可以提供物種進(jìn)化追蹤。菌株鑒定及預(yù)測耐藥性所需的基因組信息[23-25]。研究人員已證實(shí)，廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的檢測與培養(yǎng)菌株的敏感性相關(guān)，表明mNGS可提供病原菌耐藥性信息[24]。國外學(xué)者對感染CMV的5份樣本進(jìn)行mNGS，發(fā)現(xiàn)3份樣本具有更昔洛韋和纈更昔洛韋耐藥性基因突變[11]，提示眼內(nèi)液檢測可幫助我們了解病原體耐藥性或毒力表型。

3.2 疾病模型IL-10/IL-6含量比值大于1提示眼內(nèi)淋巴瘤，該指標(biāo)為診斷淋巴瘤的重要參考[33]。在非感染性葡萄膜炎中，細(xì)胞因子種類及含量各不相同。Behcet葡萄膜炎患者房水IL-10顯著低于FUS患者，而后者房水VEGF含量高[44]；小柳原田綜合征和Behcet葡萄膜炎患者房水細(xì)胞因子種類亦有差別。據(jù)此可建立不同疾病模型[9]。細(xì)胞因子在靶向治療方面亦有應(yīng)用，在TNF-α處于正常范圍的眼病中，抗TNF-α藥物，如英夫利西單抗治療無效；而在VEGF水平升高的眼病中使用抗VEGF治療有效，證明靶向治療的科學(xué)性[45-46]。與非感染性疾病類似，在眼部感染性疾病中，結(jié)合眼內(nèi)液中抗體、細(xì)胞種類和細(xì)胞因子等信息可建立感染性眼病的疾病模型，以區(qū)別不同種類病原微生物感染，給予針對性治療。