陳瑤清，馮雪英，孫佳勝，何海軍，李劍波*

（1.湖南警察學(xué)院，湖南長沙 410013；2.湖南省長沙市公安局刑偵支隊(duì)，湖南長沙 410013）

機(jī)械性窒息會引起腦內(nèi)蛋白質(zhì)和mRNA的改變[1-3]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（Glucose-Regulated Protein 78，GRP78），又稱為重鏈結(jié)合蛋白（Heavy-Chain Binding Protein，Bip），是熱休克蛋白70的一種。GRP78是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白反應(yīng)（Unfolded Protein Response，UPR）的重要調(diào)節(jié)蛋白之一[4-5]。非應(yīng)激狀態(tài)下，GRP78與三個(gè)未折疊蛋白反應(yīng)的跨膜感應(yīng)蛋白（ATF6、PERK和IRE1）相結(jié)合，若未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)大量積聚，GRP78則與跨膜蛋白分離，激活三條未折疊蛋白反應(yīng)通路，以降低蛋白翻譯水平和增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷能力。若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)不能維持動態(tài)平衡，則引起相關(guān)細(xì)胞凋亡通路激活[6]。UPR在許多疾病中具有重要的作用[5,7-11]，GRP78在腦缺血、腦缺氧和退行性疾病中具有神經(jīng)保護(hù)作用[11-14]。

微小核糖核酸（MicroRNA，miRNA）是一段內(nèi)生性的、非編碼的、長度20～24個(gè)核苷酸的小RNA，miRNA通過降解靶mRNA，抑制靶mRNA翻譯（RNA interference，RNAi）[15]或促進(jìn)靶mRNA翻譯（RNA activation，RNAa）[16]從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。miRNA調(diào)控很多重要的生理病理過程，包括細(xì)胞增殖、分化、生長和死亡[17-18]。缺血和缺氧會引起腦內(nèi)大量miRNA的改變[19-23]。近些年，研究有關(guān)miRNAs在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中作用的報(bào)道也日益增多[24-25]。

根據(jù)生物信息學(xué)軟件預(yù)測及相關(guān)研究報(bào)道可知，GRP78蛋白是miR-199a的靶基因。通過研究GRP78和miR-199a在機(jī)械性窒息大鼠各腦區(qū)中的表達(dá)情況，了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及上游miRNA在機(jī)械性窒息中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

24只雄性SD大鼠，體重（256.8±10.0）g。大鼠均從中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心購買，并在中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院SPF實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境：恒定溫度（24 ℃±2 ℃）、恒定光照（12 h光照—12 h黑暗交替），食物和水充足。

1.2 儀器與試劑

ASP300S型全自動脫水機(jī)，德國Leica；HistoCore Arcadia型石蠟包埋機(jī)，德國Leica；HistoCore BIOCUT R型石蠟切片機(jī)，德國Leica；SZX10型普通光學(xué)顯微鏡及配套照相系統(tǒng)，日本Olympus；5810R型臺式高速冷凍離心機(jī)，美國Eppendorf AG；TissueLyser Ⅱ型高通量組織研磨器，德國QIAGEN；ImageQuant LAS 4000型熒光、化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，美國GE Healthcare；OrionTMAquaMate型超微量紫外、可見光分光光度計(jì)，美國ThermoFisher Scientific；IQ5型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，美國BIO-RAD；NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)，美國ThermoFisher Scientific。

RNeasy mini試劑盒、miScriptⅡ RT試劑盒和miScript SYBR Green PCR試劑盒，德國Qiagen；Anti-GRP78 BiP抗體，美國Abcam；小鼠單克隆抗β-actin抗體，美國Sigma；HRP山羊抗兔IgG（H+L）抗體，美國GeneCopoeia；HRP馬抗鼠IgG抗體，美國CST；DAB檢測試劑盒，基因科技（上海）股份有限公司。

1.3 動物模型

實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食約12 h，允許其自由飲水。

對照組（n=12）：按照300～350 mg/kg劑量腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后快速斷頸。

勒死組（n=12）：按照300～350 mg/kg劑量腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠。將棉線圈套在大鼠頸部，用棉簽棒穿過棉線圈。朝一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)棉簽棒，使大鼠頸部受到絞勒，并維持線圈對大鼠頸部的壓力，直至大鼠死亡。大鼠平均死亡時(shí)間約3 min。

本實(shí)驗(yàn)通過了中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查。

1.4 免疫組化染色

取大鼠（n=12：勒死組n=6，對照組n=6）大腦于10%甲醛溶液中固定，進(jìn)而脫水、包埋制成蠟塊，以4 μm厚度進(jìn)行切片。Anti-GRP78 BiP抗體200倍稀釋，4 ℃過夜孵育，使用DAB試劑盒進(jìn)行顯色。形態(tài)學(xué)定量研究所使用的照片均為400×免疫組化圖片，每例隨機(jī)選取10個(gè)視野，并使用ImagePro Plus軟件計(jì)算IOD值。

1.5 Western Blot檢測

提取大鼠（n=12：勒死組n=6，對照組n=6）左側(cè)各區(qū)腦組織蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍琢繛?0 μg，上樣量為20 μL，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，PBST洗脫3次。加入Anti-GRP78 BiP抗體（1∶2 000稀釋），4 ℃緩慢搖動過夜。用PBST洗脫3次，加入1 mL山羊抗兔抗體（1∶2 000）孵育1 h，用PBST洗脫3次，采用ImageQuant Las4000mini進(jìn)行顯影。β-actin作為內(nèi)參，一抗和二抗分別為抗β-Actin抗體（1∶5 000）、馬抗鼠抗體（1∶2 000）。采用ImagePro Plus軟件測灰度值。以GRP78/β-actin IOD值為GRP78的相對表達(dá)量。

1.6 miR-199a的熒光定量PCR檢測

取大鼠（n=12：勒死組n=6，對照組n=6）右側(cè)各區(qū)腦組織于RNA組織樣本液中，置于-80 ℃冰箱保存。大腦各區(qū)分別取40 mg組織，采用RNeasy mini試劑盒提取總RNA，超微量分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量。采用The miScript Ⅱ RT試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用miScript SYBR Green PCR試劑盒和U6（內(nèi)參）、miR-199a-3p、miR-199a-5p引物進(jìn)行熒光定量PCR，以檢測目的miRNA的表達(dá)量。通過IQ5型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)獲得擴(kuò)增曲線和熔解曲線以明確擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和表達(dá)量，2（-ΔΔCt）方法計(jì)算miR-199a的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。若樣本符合正態(tài)性分布，則采用t檢驗(yàn)，否則采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05表示數(shù)據(jù)間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠腦組織內(nèi)GRP78的免疫組化染色

大鼠腦組織的免疫組化結(jié)果如圖1所示。GRP78蛋白在勒死組的皮質(zhì)、海馬和中腦組織的神經(jīng)元胞漿中強(qiáng)表達(dá)，在對照組的皮質(zhì)及中腦組織中未見強(qiáng)烈表達(dá)；無論在對照組還是勒死組，海馬區(qū)域的GRP78蛋白均為強(qiáng)陽性表達(dá)。

圖1 大鼠皮質(zhì)、海馬、中腦中GRP78蛋白的表達(dá)情況（400倍視野）

如圖2所示，采用IOD值進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，勒死組大鼠皮質(zhì)和中腦的GRP78顯著升高（P＜0.01），而海馬中GRP78表達(dá)量的改變不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖2 GRP78在對照組和勒死組大鼠皮質(zhì)、海馬、中腦區(qū)的IOD值

2.2 大鼠腦組織內(nèi)GRP78的Western Blot定量

GRP78蛋白在兩組大鼠皮質(zhì)、海馬和中腦的表達(dá)量見圖3。與免疫組化結(jié)果相似，勒死組大鼠皮質(zhì)和中腦區(qū)的GRP78/β-actin相對密度值較對照組顯著升高（P＜0.05），而兩組大鼠海馬區(qū)GRP78/β-actin相對密度值不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖3 GRP78和β-actin在大鼠腦組織表達(dá)的Western Blot結(jié)果

2.3 miRNA的定量

如圖4所示，與對照組相比，勒死組大鼠皮質(zhì)和中腦區(qū)中miR-199a-3p的表達(dá)量較對照組顯著下降（P＜0.05），而海馬區(qū)miR-199a-3p的表達(dá)量較對照組不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。勒死組和對照組大鼠皮質(zhì)、海馬和中腦區(qū)miR-199a-5p的表達(dá)量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），數(shù)據(jù)未展示。

圖4 miR-199a-3p在大鼠皮質(zhì)、海馬和中腦的相對表達(dá)量

3 討論

在勒死過程中，由于勒索對頸部動、靜脈和氣管的壓迫，大腦經(jīng)歷缺血、缺氧的病理過程，引起神經(jīng)元細(xì)胞對缺血、缺氧的應(yīng)激反應(yīng)。在慢性腦缺血中，皮質(zhì)和紋狀體在腦缺血12 h后GRP78蛋白表達(dá)顯著升高[26]，缺血灶中心GRP78蛋白減少，但缺血灶邊緣GRP78蛋白增加[25]。慢性缺氧48 h后，海馬細(xì)胞中GRP78蛋白表達(dá)增加[27]，而間歇性缺氧2周后皮質(zhì)和海馬區(qū)GRP78 mRNA顯著升高[11]。在本實(shí)驗(yàn)（急性缺血缺氧）中，GRP78在大鼠皮質(zhì)和中腦的表達(dá)量顯著增加，海馬區(qū)GRP78的改變不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明在勒死的過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被激活，且在皮質(zhì)和中腦部位尤為強(qiáng)烈，與課題組前期機(jī)械性窒息大鼠腦內(nèi)葡萄糖代謝分布的研究結(jié)果相似[28]。而對照組和勒死組海馬區(qū)GRP78異常高表達(dá)可能與存在生理性表達(dá)的GRP78蛋白有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步的研究。在勒死與其他死因的對比研究中，如果使用全腦組織進(jìn)行評價(jià)，由于海馬區(qū)域高表達(dá)的GRP78蛋白會引起結(jié)果的誤差或假性，建議選擇皮質(zhì)和中腦區(qū)域的腦組織進(jìn)行分析。

研究指出，缺血會引起神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中GRP78的升高[29]，而缺氧只引起神經(jīng)元細(xì)胞中GRP78蛋白表達(dá)升高[30]。在本實(shí)驗(yàn)中，GRP78只在神經(jīng)元細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)。一方面，勒死致頸靜脈完全阻塞，導(dǎo)致腦內(nèi)缺血缺氧，大量未折疊或錯誤折疊蛋白積聚于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，GRP78與IRE1、PERK和ATF6三個(gè)感應(yīng)蛋白分離，與未折疊或錯誤折疊蛋白結(jié)合，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。另一方面，高表達(dá)的GRP78通過抑制鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)，減少線粒體內(nèi)自由基的產(chǎn)生，對細(xì)胞有保護(hù)作用[31]。若神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)不能維持，則激活相關(guān)細(xì)胞凋亡通路，引起細(xì)胞的死亡。

在腦缺血中，腦內(nèi)多種miRNA表達(dá)量發(fā)生改變[20-23]。而在腦缺氧中，大腦皮質(zhì)miR-199a表達(dá)量下降[19]。miR-199a-3p是與缺氧密切相關(guān)的miRNA，缺氧會引起miR-199a-3p的下降[32-33]。在本研究中，大鼠皮質(zhì)和中腦區(qū)域miR-199a-3p顯著下調(diào)。miR-199a-3p對MEK/ERK和mTOR信號通路具有負(fù)性調(diào)控作用[34-35]，當(dāng)未折疊蛋白反應(yīng)不足以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過抑制MEK/ERK和mTOR信號通路激活而引起細(xì)胞的自噬和凋亡[36-37]。勒死過程中，大鼠的皮質(zhì)和中腦發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，miR-199a-3p顯著下降，可能通過上調(diào)MEK/ERK和mTOR信號通路蛋白抑制神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡和自噬，對神經(jīng)元起保護(hù)作用。

根據(jù)生物信息學(xué)軟件預(yù)測可知GRP78蛋白受上游miR-199a-5p調(diào)控，也有研究證實(shí)在腫瘤細(xì)胞和肝細(xì)胞內(nèi)，miR-199a-5p對GRP78蛋白具有調(diào)控作用，參與未折疊蛋白反應(yīng)[24-38]。本研究發(fā)現(xiàn)，GRP78蛋白在皮質(zhì)和中腦區(qū)表達(dá)量顯著下降，而miR-199a-5p在各腦區(qū)的表達(dá)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。一方面，在急性應(yīng)激情況下，GRP78蛋白與IRE1、PERK和ATF6分離，與未折疊蛋白大量結(jié)合，導(dǎo)致GRP78蛋白表達(dá)升高，而mRNA水平可能未有顯著變化；另一方面，GRP78蛋白可能同時(shí)受多個(gè)miRNA的調(diào)控[24]。

4 結(jié)論

綜上所述，在機(jī)械性窒息過程中，大鼠腦內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路被激活，在皮質(zhì)和中腦區(qū)尤為顯著，上游miR-199a參與機(jī)械性窒息的調(diào)控作用。