房立春，胡宇航，李月濤，劉 濤，亓麗紅，吳家強，趙 鵬，朱鴻飛

（1.山東省農業(yè)科學院，山東濟南 250100；2.河南科技學院，河南新鄉(xiāng) 453003；3.山東農業(yè)大學動物科技學院，山東泰安 271018；4.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

免疫刺激是DNA 作為遺傳物質之外的另一重要屬性和功能[1]，一部分短的非表達序列DNA通常具有這種功能。這些普遍存在于細菌、病毒及非脊椎動物基因組中的特定短核苷酸序列，通常被稱為CpG 免疫刺激序列[2]。已有試驗[3]證明，化學方法合成的含有CpG-ODN（oligo deoxynucleotide，寡聚脫氧核昔酸）的重組質粒具有同細菌中含有CpG 基序的寡聚脫氧核苷酸（CpG DNA）相似的免疫刺激活性。CpG DNA 還能增強抗原特異性免疫應答，從而表現(xiàn)出強烈的佐劑活性，而且已在人和多種動物中獲得證實[4-7]。

目前，大量試驗[8-10]已證明，CpG DNA 能有效刺激活化多種家畜和家禽的免疫系統(tǒng)，而且體內試驗已經證實，用大腸桿菌 CpG DNA 與雞新城疫滅活疫苗同時接種雞，能提高抗原的特異性免疫應答，誘導高水平保護性抗體。然而，CpG DNA對H9 亞型禽流感病毒（AIV-H9）滅活疫苗免疫效果增強作用的系統(tǒng)性試驗鮮有報道。本研究應用商品化的含有CpG 基序序列即CpG DNA 的重組質粒作為AIV-H9 滅活疫苗佐劑，共同免疫不同日齡的SPF 雛雞，觀察其免疫效應，目的在于分析CpG DNA 對AIV-H9 滅活疫苗的免疫增強作用，為商品化的CpG DNA 作為疫苗免疫佐劑提供有價值的理論依據；同時根據不同日齡雛雞初免后的抗體消長情況和外周血淋巴細胞CD4、CD8 分子的mRNA 表達水平，為AIV-H9 滅活疫苗聯(lián)合使用CpG DNA 免疫增強佐劑的免疫程序提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 CpG DNA 分子免疫增強劑

CpG DNA 重組質粒購自南京太和生物技術有限公司，在配制評價用疫苗前進行適當稀釋，使用劑量為每羽份40 μg。

1.2 抗原和主要試劑

AIV-H9 F 株滅活抗原，由中崇信諾生物科技研發(fā)項目部提供；AIV-H9 HA 抗原，購自青島易邦生物工程有限公司；吐溫、司本、白油佐劑（Marcol 52 白油），由淄博嘉馳石油化工有限公司提供。PBS 緩沖液，購自大連美倫生物技術有限公司。

1.3 試驗動物

90 只SPF 雞（1、7、21 日齡各30 只），購自山東濟南斯帕法斯家禽有限公司。

1.4 評價用疫苗制備

將白油與司本按94:6 的體積比，攪拌混合均勻后高壓滅菌，121 ℃維持30 min；配置油相，冷卻后備用；AIV-H9 滅活抗原與指定劑量的CpG DNA 免疫增強劑或生理鹽水混合，將混合物與吐溫按96:4 的體積比混合，200 r/min 攪拌5 min，使吐溫完全溶解，配置水相；將油相300 mL（水相體積的3 倍）加入500 mL 高腳燒杯中，開動疫苗乳化機，200 r/min 轉速攪拌，同時緩慢加入水相100 mL，升高轉速至8 000 r/min 攪拌10 min。具體配苗比例見表1。

1.5 動物試驗

對1、7 和21 日齡SPF 雞各10 羽，分別免疫添加CpG DNA 佐劑的AIV-H9 滅活疫苗和未添加佐劑的AIV-H9 滅活疫苗，每羽頸部皮下注射0.5 mL，另各設10 羽作為空白對照，注射同劑量PBS 緩沖液。

1.6 HI 抗體測定

所有免疫的1 日齡與7 日齡SPF 雞，在免疫3 周后，連續(xù)4 周，每周采集靜脈血，分離血清，-20 ℃保存；所有免疫的21 日齡SPF 雞，在免疫后每周采集靜脈血，連續(xù)4 周分離血清，-20 ℃保存。血清樣品同時按照《中國獸藥典》中血凝抑制（HI）試驗操作規(guī)程測定針對AIV-H9 的抗體。為盡最大可能避免操作誤差，所有雞的血清使用同一批次試劑，在相同條件下，由相同人員在同一次操作中進行檢測。每個樣品重復1 次，如果2 次差異較大則再次重復。

1.7 CD4、CD8 mRNA 表達水平測定

所有1、7、21 日齡的SPF 雞在免疫3 周后，采集靜脈血，參照岳華等[11]建立的RT-PCR 方法檢測雞CD4、CD8 基因表達水平，以雞β-actin 作為內參，以未添加佐劑的AIV-H9 滅活疫苗組為對照，采用2-??ct法[12]計算CD4、CD8 分子mRNA相對表達水平。

2 結果

2.1 不同日齡SPF 雞免疫抗體消長比較

結果（表2～4）顯示：SPF 雞在21 日齡首次免疫，比在1 日齡和7 日齡免疫的效果更好。免疫疫苗后，各組針對AIV-H9 的抗體逐漸上升，21 日齡免疫組上升速度更快；在免疫添加CpG DNA 免疫增強劑疫苗情況下，1 日齡與7 日齡免疫的HI抗體峰值約為9log2，并且兩組的HI 抗體滴度差異不顯著（P＞0.05），21 日齡免疫的HI 抗體峰值約為11log2，與其他日齡相比增高約2log2 滴度，差異顯著（P≤0.05）；21 日齡免疫的HI 抗體離散度小，均勻度優(yōu)于1 日齡與7 日齡。

表2 1 日齡SPF 雞免疫后不同時間HI 抗體消長規(guī)律

表3 7 日齡SPF 雞免疫后不同時間HI 抗體消長規(guī)律

表4 21 日齡SPF 雞免疫后不同時間HI 抗體消長規(guī)律

2.2 CpG DNA 免疫增強劑對HI 抗體的影響

不同日齡SPF 雞初次免疫后不同時間點的HI抗體水平（表2～4）顯示，免疫添加CpG DNA免疫增強劑的AIV-H9 滅活疫苗抗體滴度比未添加升高明顯。1 日齡SPF 雞免疫后第3～6 周，添加CpG DNA 免疫增強劑組比未添加組分別升高1.79log2、0.64log2、2.08log2、2.07log2，而且第5周和第6 周的HI 抗體滴度差異極顯著（P≤0.01）；7 日齡SPF 雞免疫后第3～6 周，添加CpG DNA 免疫增強劑組的HI 抗體滴度比未添加組分別升高2.23log2、2.40log2、1.28log2、1.26log2，差異均極顯著（P≤0.01）；21 日齡SPF 雞免疫后第1～4 周，添加CpG DNA 免疫增強劑組的HI 抗體滴度比未添加組分別升高0.72log2、2.71log2、2.20log2、1.01log2，除第1 周外，其他各時間點的HI 抗體滴度差異均極顯著（P≤0.01）。在相同日齡免疫的情況下，添加CpG DNA 免疫增強劑疫苗組的HI 抗體峰值滴度更高，與未添加組相比，統(tǒng)計學差異極顯著（P≤0.01），HI 抗體上升速度也更快，且高峰的維持時間更長（圖1～2）。

2.3 CpG DNA 免疫增強劑對CD4、CD8 mRNA表達水平的影響

以未添加CpG DNA 免疫增強劑組雛雞外周血淋巴細胞CD4、CD8 mRNA 表達水平為1，對比不同日齡SPF 雞初次免疫后第3 周的外周血淋巴細胞CD4、CD8 mRNA 表達水平。結果（圖3）顯示：免疫添加CpG DNA 免疫增強劑組的CD4、CD8 mRNA 表達水平均高于未添加組，且7 日齡和21 日齡組的CD4 和CD8 基因表達水平明顯高于1 日齡組（P≤0.01）；21 日齡免疫添加CpG DNA 免疫增強劑組的CD4、CD8 mRNA 表達水平均高于其他日齡組。

3 討論

CpG DNA 作為一種安全、經濟、有效的新型疫苗佐劑，具有其他佐劑無法比擬的優(yōu)勢[13]。國外學者Rankin 等[14]研究證實，CpG ODN 具有較好的安全性，使用劑量低，無毒副作用。另外CpG 基序還可誘導機體發(fā)揮先天性的抗病毒作用。目前，CpG 已成為人類醫(yī)學和動物醫(yī)學領域的研究熱點，并顯示出了廣闊的應用前景。國內學者李杰等[15]利用CpG DNA 佐劑進行雞新城疫活疫苗的免疫效果觀察，結果發(fā)現(xiàn)CpG DNA 能顯著增強雞對新城疫LaSota活疫苗的體液和細胞免疫反應。

當前，進行疫苗免疫接種仍是我國防控禽流感的主要手段[16]。近年來，在我國部分省市規(guī)?；B(yǎng)殖場的禽流感調查[17]中發(fā)現(xiàn)，H9 亞型陽性雞群占總禽流感抗體陽性雞群的93.67%，證明H9 亞型禽流感仍然在我國廣泛存在，并給養(yǎng)雞場造成了巨大經濟損失。因此，如何提高疫苗的免疫效果成為禽流感免疫防控中的重要研究課題。本研究首次將商品化的含有CpG DNA 重組質粒，配伍白油等制成AIV-H9 滅活疫苗，通過免疫不同日齡的SPF雛雞，觀察了CpG DNA 重組質粒對AIV-H9 滅活疫苗的免疫增強效應。

目前廣泛認可，在HI 抗體滴度高于4log2 時，禽流感滅活疫苗具有較好的保護效果，因此較早地達到并超過這個滴度能極大減少雞群感染禽流感病毒的風險。本研究發(fā)現(xiàn)：在CpG DNA 作用下，試驗組HI 抗體滴度上升速度更快，21 日齡SPF 雞免疫后第1 周AIV-H9 ＋CpG 組即達到了4.44log2，而未添加組僅為3.72log2，差異顯著（P≤0.05）；免疫后第2 周AIV-H9 ＋CpG 組HI 抗體滴度為9.62log2，而未添加組為6.91log2，兩組較第1 周分別上升了5.18log2 和3.19log2，AIV-H9 ＋CpG組表現(xiàn)出了更快的上升速度；在相同日齡免疫的情況下，添加CpG 免疫增強劑疫苗組的HI 抗體峰值滴度均高于未添加組，升高近2 個滴度，差異極顯著（P≤0.01）并且高峰期維持時間更長，顯示出更好的保護效果，能帶給雞群更好的抵抗病毒的免疫能力。這些都是評價疫苗優(yōu)劣的重要指標。

另外，本研究對免疫含有CpG DNA 滅活疫苗的不同日齡SPF 雞HI 抗體水平進行了初步探究。結果表明：在21 日齡進行CpG DNA 聯(lián)合AIV-H9滅活疫苗免疫比在1、7 日齡免疫效果更好，不僅HI 抗體滴度更高而且離散程度小。1 日齡與7 日齡免疫效果差距不明顯，對比差異不顯著，其原因可能是低日齡免疫時其自身免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟。而CpG DNA 在提高HI 抗體水平上，主要是直接刺激B 細胞，減少B 細胞凋亡，還使B 細胞表面MHC Ⅱ類（major histocompatibility complex class II）抗原以及共刺激因子 B7-1、B7-2 表達量增加[18-19]，并且由于大日齡雞的免疫系統(tǒng)相對成熟，所以其CpG DNA 的免疫增強效果更好。

CD4+T 細胞可與MHCII 類分子遞呈的多肽抗原發(fā)生反應而被激活產生免疫反應，CD8+T 細胞可以識別MHCI 類（major histocompatibility complex class I）分子遞呈的抗原，并直接殺死感染或變異細胞[20]。CD4+T 細胞與CD8+T 細胞的數(shù)量及狀態(tài)反映了機體免疫力的高低[21-22]。本研究通過測定分析外周血淋巴細胞中 CD4 和 CD8 的基因相對表達水平，來評估機體細胞的免疫狀態(tài)，初次免疫后，添加CpG DNA 免疫增強劑組的CD4、CD8 mRNA 表達水平均高于未添加組，且在21 日齡時差異水平最大。該結果說明，CpG DNA 免疫增強劑能夠激活雞免疫細胞，提高外周血T 淋巴細胞中CD4、CD8 的相對表達水平，間接表明免疫增強劑促進了T 淋巴細胞的增殖和分化，從而提高了機體的免疫水平。

本研究表明，CpG DNA 重組質粒能顯著激活雞的免疫系統(tǒng)，增強雞對AIV-H9 滅活疫苗的特異性體液免疫應答，尤其對21 日齡雞作用更明顯。這提示，CpG DNA 重組質粒可作為禽流感滅活疫苗的高效免疫增強劑。本研究為CpG DNA 重組質粒在禽流感疫苗上的聯(lián)合應用以及研制新型復合佐劑疫苗提供了依據。