姜陽(yáng)陽(yáng)，成志強(qiáng)，游淑源

淋巴結(jié)活檢的主要作用是對(duì)惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移進(jìn)行分級(jí)，明確腫瘤轉(zhuǎn)移的具體范圍，減少不必要的手術(shù)及術(shù)后并發(fā)癥[1]。術(shù)中冷凍切片能在較短時(shí)間內(nèi)獲得淋巴結(jié)的病理診斷結(jié)果，對(duì)手術(shù)治療方式和手術(shù)范圍具有較高的指導(dǎo)作用，因此越來(lái)越受到臨床醫(yī)師的青睞。淋巴結(jié)組織由于其細(xì)胞豐富，質(zhì)地較脆，外圍常有脂肪包繞，在日常冷凍切片工作中較難獲取高質(zhì)量切片。固定是影響冷凍切片質(zhì)量的主要因素之一[2]，組織固定欠佳直接導(dǎo)致染色質(zhì)量差，嚴(yán)重影響診斷的準(zhǔn)確性。本科室采用不同固定液對(duì)淋巴結(jié)冷凍切片進(jìn)行HE染色，取得良好的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2020年6～8月我院手術(shù)室送檢新鮮淋巴結(jié)標(biāo)本，淋巴結(jié)直徑均大于0.5 cm，合計(jì)30枚，均符合快速病理標(biāo)本送檢要求。

1.2 試劑及儀器試劑：甲醇，冰醋酸，Harris蘇木精染色液，伊紅(醇溶性)，櫻花OCT包埋劑，無(wú)水乙醇，二甲苯，1% 碳酸鋰水溶液，中性樹(shù)膠等。A液 ∶甲醇；B液：冰醋酸-甲醇液(冰醋酸 ∶甲醇=5 ∶95)；C液：冰醋酸-95%乙醇液(冰醋酸 ∶95%乙醇=5 ∶95)。儀器：恒溫冷凍切片機(jī)(Leica CM1950)，生物顯微鏡(OLYPMUS BX40)。

1.3 方法送檢的新鮮淋巴結(jié)組織，規(guī)范取材后行冷凍切片。實(shí)驗(yàn)前將A、B、C液放置在冷凍切片機(jī)內(nèi)，預(yù)冷至機(jī)箱溫度(-20 ℃)。常規(guī)冷凍切片(5 μm厚)，每例淋巴結(jié)連續(xù)做 9張切片，分別浸泡于3種不同固定液中，固定時(shí)間分別為 15、30、60 s。待固定完成后，流水沖洗，收集所有切片置于染色架中，流水沖洗20 s后染色。染色步驟：蘇木精染色液60 s，流水沖洗10 s，1%碳酸鋰水溶液返藍(lán)5 s，流水沖洗10 s，伊紅溶液10 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

1.4 結(jié)果判斷所有切片均由本科室兩名副主任醫(yī)師采用雙盲法閱片，從組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞核形態(tài)、細(xì)胞核染色、細(xì)胞質(zhì)染色和核質(zhì)對(duì)比等5項(xiàng)進(jìn)行評(píng)分，單項(xiàng)總分為10分，無(wú)法診斷計(jì)為0分。

2 結(jié)果

2.1 HE染色本實(shí)驗(yàn)經(jīng)A液固定15、30 s的切片：鏡下組織結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞核腫脹，核染色和胞質(zhì)染色對(duì)比度差。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)C液固定15、30 s的切片：鏡下見(jiàn)細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞核輕度縮小，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)對(duì)比度較好。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)B液固定15、30、60 s的三組切片：鏡下組織結(jié)構(gòu)均完整，細(xì)胞形態(tài)清晰，核仁清晰可見(jiàn)，細(xì)胞核和細(xì)胞染色良好。經(jīng)A液固定60 s的切片和經(jīng)C液固定60 s的切片：組織結(jié)構(gòu)均清晰，未見(jiàn)細(xì)胞腫脹和收縮，核質(zhì)對(duì)比度好(圖1～4)。

2.2 評(píng)分本組結(jié)果顯示：A液組和C液組平均分隨著固定時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，平均得分：固定60 s>固定 30 s>固定15 s。B液組平均分相對(duì)較為穩(wěn)定(表1)。

表1 三種固定液固定不同時(shí)間的HE染色評(píng)分

2.3 單因素方差分析固定15 s和固定30 s時(shí)，固定液影響冷凍切片HE染色質(zhì)量(P<0.01)，平均分：B液組>C液組>A液組。進(jìn)一步兩兩比較，B液組和其他兩組評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示冷凍切片在B液中固定15、30 s時(shí)染色質(zhì)量?jī)?yōu)于其他兩種固定液。固定60 s時(shí)，方差分析結(jié)果表明三種固定液評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.733)，提示固定液不是影響染色評(píng)分的因素。進(jìn)一步兩兩比較，B液與A、C液組評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.918)，A液組與C液組評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.711)，提示固定60 s時(shí)，三組切片均獲得良好的染色效果。

圖1 淋巴結(jié)：A液(甲醇)固定15 s,組織結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞明顯腫脹

3 討論

影響淋巴結(jié)冷凍切片的因素較多，如規(guī)范取材、冷凍速度、切片技巧、固定和染色均是影響切片質(zhì)量的主要因素。淋巴結(jié)通常多份標(biāo)本同時(shí)送檢，淋巴組織內(nèi)摻雜脂肪，制片難度大，切片時(shí)間長(zhǎng)，診斷難度大，而淋巴結(jié)冷凍切片的診斷直接關(guān)系手術(shù)進(jìn)度和手術(shù)方式。淋巴結(jié)內(nèi)纖維少，細(xì)胞豐富，尤其是核質(zhì)比高的淋巴細(xì)胞染色質(zhì)極為豐富，良好的固定十分重要。優(yōu)質(zhì)的固定液，不僅能保證組織形態(tài)原有結(jié)構(gòu)的完整功能，還能最大限度減少冷凍切片與石蠟切片在組織細(xì)胞形態(tài)上的差異[3]。

本實(shí)驗(yàn)評(píng)估淋巴結(jié)冷凍切片經(jīng)3種固定液固定，HE染色均獲得高質(zhì)量的淋巴結(jié)冷凍切片，鏡下表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)清晰、顏色鮮艷，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈不同程度紅色，細(xì)胞形態(tài)清晰，細(xì)胞核規(guī)則，細(xì)胞間隙無(wú)明顯增大，核質(zhì)對(duì)比度良好，核仁和染色質(zhì)清晰。甲醇為沉淀類固定劑，對(duì)組織滲透性強(qiáng)，能迅速沉淀清蛋白、球蛋白和核蛋白[4]。95%乙醇對(duì)抗原性保存較好，能沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白，但核蛋白被沉淀后溶解于水，造成組織收縮。因此，95%乙醇作為單純的固定液不理想[5]。多項(xiàng)研究證實(shí)，固定液中添加一定濃度的冰醋酸對(duì)細(xì)胞破壞小，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)染色對(duì)比鮮明，本實(shí)驗(yàn)也獲得類似的結(jié)論。

冷凍切片固定時(shí)間不夠主要表現(xiàn)為細(xì)胞核腫脹，染色對(duì)比度差，組織結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞收縮等。本次實(shí)驗(yàn)中對(duì)比了不同固定時(shí)間對(duì)淋巴結(jié)冷凍切片HE染色質(zhì)量的影響，獲得高質(zhì)量的染色切片，甲醇和冰醋酸-95%乙醇液需要固定60 s，而冰醋酸-甲醇液只需固定15 s，明顯優(yōu)于另外兩種固定液。冰醋酸的穿透能力強(qiáng)，能沉淀核蛋白，可較好地保存染色體的結(jié)構(gòu)，冰醋酸加速蛋白質(zhì)沉淀，尤其核蛋白沉淀，提升細(xì)胞核染色質(zhì)量。冰醋酸-95%乙醇液固定未見(jiàn)核蛋白溶解，切片顯示細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色質(zhì)量較高，短時(shí)間固定會(huì)引起細(xì)胞收縮，但不影響診斷。冰醋酸對(duì)組織有膨脹作用，經(jīng)冰醋酸-95%乙醇液固定60 s，冷凍切片染色質(zhì)量高，未見(jiàn)明顯細(xì)胞間隙，95%乙醇能快速引起細(xì)胞收縮，而冰醋酸對(duì)組織的膨脹作用較緩慢，95%乙醇的收縮作用與冰醋酸的膨脹作用相抵消需要固定時(shí)間，實(shí)驗(yàn)證明在固定60 s時(shí)取得較好的效果。

本實(shí)驗(yàn)顯示冰醋酸-甲醇混合液配制簡(jiǎn)單，固定時(shí)間短，效果好，有利于快速制片，是一種理想的淋巴結(jié)冷凍切片固定液。