齊中強，杜 艷，潘夏艷，文友義，于俊杰，張榮勝，俞咪娜，曹慧娟，宋天巧，李連偉，劉永鋒

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，南京 210014；2.江蘇師范大學生命科學學院，江蘇 徐州 221116)

【研究意義】由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是水稻生產(chǎn)上最重要的一種病害，在全世界稻區(qū)均有發(fā)生，嚴重威脅世界糧食安全生產(chǎn)[1-2]。稻瘟病菌屬于子囊菌，其與水稻的互作模式符合“基因?qū)颉奔僬f，因此稻瘟病菌—水稻互作模式已經(jīng)成為研究植物與病原菌互作的模式系統(tǒng)[3-4]。稻瘟病菌主要通過分生孢子侵染水稻，能夠?qū)λ菊麄€生育期造成危害，侵染過程同樣受到水稻和外界環(huán)境的影響，細胞壁是感受這些壓力最重要的結(jié)構(gòu)[5]。【前人研究進展】質(zhì)子依賴型MFS(Major Faciitator superfamily)轉(zhuǎn)運蛋白屬于膜蛋白的一類，主要介導生物膜內(nèi)外的化學物質(zhì)和信號交換，在營養(yǎng)物質(zhì)攝取，代謝產(chǎn)物釋放以及信號轉(zhuǎn)導等細胞活動中起著重要作用[6-7]。MFS轉(zhuǎn)運蛋白是一類非常古老、在各個物種中都起著重要作用的轉(zhuǎn)運蛋白[8]，一般由400～800個氨基酸殘基形成12或14個跨膜結(jié)構(gòu)域。MFS超家族蛋白可以轉(zhuǎn)運單糖、多糖、氨基酸、多肽、維生素、酶輔因子、藥物分子、發(fā)色團、堿基等眾多小分子[9-10]。MFS超家族轉(zhuǎn)運蛋白不但在眾多物質(zhì)的轉(zhuǎn)運過程中起著至關(guān)重要的作用，同時還與病毒入侵、病菌抗藥性等免疫學問題密切相關(guān)[11]。【本研究切入點】本研究利用基因敲除的方法，對稻瘟病菌MFS轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因MoMFS2的生物學功能進行解析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】明確MFS轉(zhuǎn)運蛋白MoMfs2在稻瘟病菌致病性及物質(zhì)轉(zhuǎn)運和對殺菌劑的外排中的作用，為新型殺菌劑的研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)Guy11由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植保所水稻病害防控創(chuàng)新團隊保存。水稻為感病品種CO39。

1.2 敲除載體構(gòu)建及稻瘟病菌敲除轉(zhuǎn)化

通過稻瘟病菌全基因組公布序列網(wǎng)站，將預測到的MoMFS2基因(MGG_01301)序列下載。敲除載體構(gòu)建具體方法如下：將M.oryzae基因組數(shù)據(jù)庫中MoMFS2基因上、下游各1 kb左右的DNA序列作為同源重組的上、下兩臂，構(gòu)建基因敲除載體。以野生型Guy11基因組DNA為模板，分別用引物mfs2-p1 (F)/mfs2-p2 (R)和mfs2-p3 (F)/mfs2-p4 (R) 擴增上、下臂片段，以質(zhì)粒pCB1003為模板，用引物FL1111 (F)/FL1112 (R) 高保真PCR擴增抗性篩選基因—潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(HPH)，經(jīng)電泳、切膠回收將上述3個PCR產(chǎn)物純化。利用同源重組酶(諾唯贊C112)將上述3個片段和pMD19-T simple vector(TaKaRa, Dalian, China)進行連接，得到質(zhì)粒pMD::MFS2::HPH，以該質(zhì)粒為模板，用引物mfs2-p1 (F)/mfs2-p4 (R) 擴增得到約3.4 kb的敲除片段用于M.oryzae的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。M.oryzae原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參照文獻[13]。

1.3 轉(zhuǎn)化子驗證及Southern雜交

將轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA(CTAB法)，用引物mfs2-p5 (F)/mfs2-p6 (R)進行驗證，隨后將驗證得到的候選突變體進行Southern雜交。以稻瘟病菌野生型Guy11基因組DNA為模板，用引物mfs2-p5 (F)/mfs2-p6 (R)擴增出MoMFS2基因內(nèi)部503 bp的片段作為探針，并用地高辛標記。Guy11菌絲基因組DNA經(jīng)Hind III于1.0%瓊脂糖凝膠中過夜電泳，充分分離酶解片段，然后轉(zhuǎn)移至帶正電的尼龍膜(HybondTM-N+, Amersham, Biosciences UK Limited)上，與地高辛標記的探針于58 ℃雜交過夜。Southern雜交過程參照digoxigenin high-prime DNA labeling and the detection starter kit 1(Roche, Germany)的操作手冊。以上引物列表在Table 1。

1.4 分生孢子形成測定

將野生型Guy11及敲除突變體接種在SDC培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d左右，待菌絲體長滿平板后，用手術(shù)刀將表面氣生菌絲刮掉，于黑光燈下照射3 d，誘導分生孢子產(chǎn)生。收集孢子時，向培養(yǎng)基內(nèi)加入3 mL無菌水，輕輕用1.5 mL EP管底部將表面氣生菌絲和孢子刷下，后經(jīng)過4層擦鏡紙過濾以收集孢子。

1.5 附著胞形成測定

將蓋玻片(Fisherbrand，12-540-A 18×18-2)放置在載玻片上(下面滴加無菌水)，取40 μL濃度為5×104個/mL的分生孢子液，滴加于蓋玻片中央，隨后將載玻片放入培養(yǎng)皿中28 ℃黑暗保濕培養(yǎng)，2、4、6、8、24和48 h后分別制片觀測附著胞形成率。每次實驗設置3個重復。

1.6 水稻噴霧及大麥離體致病性測定

將刷下的孢子濃度調(diào)至5×104個/mL，加入0.25%明膠，利用生長14 d水稻進行噴霧，28 ℃黑暗培養(yǎng)24 h，隨后16 h光照，8 h黑暗處理期間需要保持高溫高濕狀態(tài)。接種5～7 d后，觀察結(jié)果。

大麥離體致病性測定，剪取生長7 d的大麥葉片鋪于含有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中，孢子液濃度調(diào)至5×104個/mL，加入0.25%明膠，每片葉片滴3滴調(diào)好濃度的孢子液，以水做對照，置于28 ℃黑暗培養(yǎng)24 h，隨后16 h光照，8 h黑暗處理。接種5～7 d后，觀察結(jié)果。每次實驗設置3個重復，試驗重復3次。

1.7 原生質(zhì)體釋放測定

野生型和突變體菌株在含CM培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)6 d后，切取3 mm見方的菌絲塊置于CM培養(yǎng)液中，28 ℃搖培48 h，然后用濾紙過濾收集菌絲體，并用吸水紙吸干。各稱取0.2 g 菌絲體分別置于2 mL 含有0.7 mol/L NaCl 配制的酶解液(濃度：10 μg/mL)中進行酶解。每隔30 min 終止酶解反應，并用血球計數(shù)板來統(tǒng)計原生質(zhì)體釋放數(shù)目。試驗重復3次，每次設置3個重復，實驗結(jié)果取平均值。

1.8 細胞壁脅迫因子敏感性分析

從CM培養(yǎng)基上生長6 d的菌落邊緣上，切取3 mm見方的菌絲塊，接種于直徑60 mm的加入不同濃度脅迫因子的CM平板中，28 ℃黑暗培養(yǎng)6 d后測量菌落直徑并拍照，試驗重復3次，每次設3個重復，結(jié)果取平均值。本實驗所用脅迫因子及濃度：SDS為0.005%，0.01%，0.02%；Congo Red為200和400 μg/mL。

為構(gòu)建嚴格的標識制度，首先應當修訂轉(zhuǎn)基因食品標識目錄。目前，我國的轉(zhuǎn)基因食品已經(jīng)得到很大發(fā)展，但標識目錄仍然沿用著2002年農(nóng)業(yè)部公布的五類十七種轉(zhuǎn)基因食品標識目錄，經(jīng)過15年的發(fā)展，該目錄已經(jīng)不適合我國現(xiàn)在的需要，因此亟需修訂轉(zhuǎn)基因食品標識目錄。除了建立完備的標識目錄，在標識內(nèi)容上也應當嚴格進行規(guī)定。需要規(guī)定的內(nèi)容主要有：標識文本、標識位置、標識顯著程度、成分含量、副作用等五個方面。為防轉(zhuǎn)基因食品生產(chǎn)企業(yè)鉆漏洞，還應合理設置兜底條款。[7]

1.9 不同類型殺菌劑(咪鮮胺、多菌靈和嘧菌酯)敏感性測定

從CM培養(yǎng)基上生長6 d的菌落邊緣上，切取3 mm見方的菌絲塊，接種于直徑60 mm的加入不同濃度殺菌劑的CM平板中，28 ℃黑暗培養(yǎng)6 d后測量菌落直徑并拍照，試驗重復3次，每次設3個重復，結(jié)果取平均值。本實驗所用殺菌劑及濃度：咪鮮胺為0.0025，0.0250，0.2500 μg/mL；嘧菌酯為0.0025，0.0250，0.2500 μg/mL；多菌靈為0.1，0.5 μg/mL。

1.10 胞外漆酶及過氧化物酶活性的檢測

在CM培養(yǎng)基上切取生長5 d的3 mm見方的菌絲塊接種到直徑6 cm的含有0.2 mmol/L ABTS的CM培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)24 d后觀察并拍照，實驗重復3次。過氧化物酶活性檢測見上面剛果紅脅迫測定實驗，分光光度計測定2種酶的含量方法參照張等[12]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 MoMfs2蛋白進化分析

通過真菌數(shù)據(jù)庫(https://fungidb.org/fungidb/app)下載MoMfs2的氨基酸序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進行同源比對并下載代表性物種氨基酸序列利用MEGA進行進化樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與MoMfs2蛋白(XP 003714224.1)最近的是梨胞屬真菌(XP 030983394.1和XP 029752700.1)，其次是核盤菌(APA08026.1)和白腐小核菌(KAF7874946.1)。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

圖1 MoMfs2系統(tǒng)進化樹分析Fig.1 Phylogenetic analysis of MoMfs2 and other Mfs2 homologues

2.2 MoMFS2基因敲除突變體的獲得

利用同源重組原理對MoMFS2基因在稻瘟病菌中進行了定向敲除，獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)初步驗證得到#28和#101兩個轉(zhuǎn)化子。隨后進行Southern雜交進行進一步確認，結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)2個突變體用基因探針沒有雜出約7.3 kb條帶，說明MoMFS2基因已被成功敲除；進一步用潮霉素探針雜出了約6.6 kb條帶，證明MoMFS2基因已被潮霉素基因成功替換。以下實驗均以#28號作為研究對象。

1：野生型菌株Guy11基因組(Hind III酶切)；2：敲除突變體ΔMomfs2 #28基因組(Hind III酶切)；3：敲除突變體ΔMomfs2 #101基因組(Hind III酶切)1：The genome DNA of wild type strain Guy11 (digested with Hind III); 2: The genome DNA of the knockout mutant ΔMomfs2 #28 (digested with Hind III); 3: The genome DNA of the knockout mutant ΔMomfs2 #101 (digested with Hind III)圖2 MoMFS2敲除突變體Southern雜交驗證Fig.2 Southern blot of MoMFS2 deletion mutants

2.3 MoMFS2基因不參與稻瘟病菌營養(yǎng)吸收與利用

為了研究MoMfs2在營養(yǎng)吸收和利用中的作用，將野生型Guy11和#28突變體及互補轉(zhuǎn)化子分別接種到CM、MM、SDC、OM培養(yǎng)基上檢測其生長情況。結(jié)果顯示，不管是在天然培養(yǎng)基(SDC和OM)還是在合成培養(yǎng)基(CM和MM)上，突變體生長狀態(tài)和生長速率較野生型均沒有變化(圖3～4)。結(jié)果表明，MoMFS2不參與稻瘟病菌營養(yǎng)吸收與利用。

Guy11：野生型菌株；ΔMomfs2：敲除突變體；ΔMomfs2/MoMFS2：互補轉(zhuǎn)化子；CM：完全培養(yǎng)基；MM：基本培養(yǎng)基；SDC：產(chǎn)孢培養(yǎng)基；OM：燕麥培養(yǎng)基Guy11: Wild type strain; ΔMomfs2: The deletion mutant; ΔMomfs2/MoMFS2: The complementary mutant; CM: Complete medium; MM: Minimal medium; SDC: Corn agar medium; OM: Oat medium圖3 MoMFS2敲除突變體在CM、MM、SDC和OM培養(yǎng)基上的生長情況Fig.3 The growth of MoMFS2 deletion mutant on CM, MM, SDC and OM medium

圖4 MoMFS2敲除突變體在不同培養(yǎng)基上的生長速率差異Fig.4 Difference in growth rate of MoMFS2 deletion mutant on different medium

2.4 MoMFS2基因敲除突變體原生質(zhì)體釋放速率

為了分析MoMFS2敲除突變體原生質(zhì)體釋放，將野生型、突變體和互補轉(zhuǎn)化子進行28 ℃液培，隨后放入0.75%幾丁質(zhì)裂解酶解液中，30、60和90 min后對釋放的原生質(zhì)體進行計數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因敲除突變體原生質(zhì)體釋放速率較野生型變慢(圖5)，表明其細胞壁完整性發(fā)生了改變。為了驗證這個結(jié)論，利用細胞壁脅迫因子剛果紅和SDS(十二烷基磺酸鈉)，將野生型、敲除突變體和互補轉(zhuǎn)化子分別接種到含有不同濃度的藥劑CM平板上，28 ℃、黑暗培養(yǎng)7 d后測量3個菌株的菌落直徑并且統(tǒng)計在不同濃度藥劑處理條件下的抑制率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體在低濃度剛果紅和SDS平板上抑制率均顯著下降(表2)，表明該突變體對2種細胞壁脅迫耐受性增強。進一步證明了MoMFS2參與了稻瘟病菌細胞壁完整性。

*代表差異達0.05顯著水平* represents significant difference of 0.05 level圖5 MoMFS2突變體原生質(zhì)體釋放速率變化Fig.5 Change of the rate of protoplast release of the MoMFS2 mutant

表2 MoMFS2敲除突變體在不同脅迫條件下的抑制率Table 2 Inhibition rate of MoMFS2 detletion mutant on various stress conditions (%)

2.5 MoMFS2參與胞外漆酶和過氧化物酶的外泌作用

MFS轉(zhuǎn)運蛋白主要行使轉(zhuǎn)運小分子化合物作用[10]。為了分析MoMFS2是否參與到稻瘟病菌的外泌過程，利用2種底物對胞外漆酶和過氧化物酶的外泌作用進行測定。外源ABTS可以作為漆酶的底物，被氧化后形成絳紫色物質(zhì)，將野生型Guy11和#23突變體及互補轉(zhuǎn)化子分別接種到含有0.2 mmol/L ABTS的CM培養(yǎng)基中。28 ℃、黑暗培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)突變體不能形成紫色暈圈，同時通過光密度測量，突變體幾乎不分泌胞外漆酶(圖6-c～圖6-d)。另外，胞外過氧化物酶可以催化剛果紅降解形成水解圈[14]，對該突變體胞外過氧化物酶的分泌進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體不產(chǎn)生水解圈，同時光密度測定結(jié)果顯示基本不分泌胞外過氧化物酶(圖6-a～圖6-b)。上述結(jié)果表明MoMFS2參與了稻瘟病菌胞外漆酶和過氧化物酶的分泌。

**代表差異達0.01顯著水平** represents significant difference of 0.01 level圖6 MoMFS2敲除突變體對胞外漆酶和過氧化物酶的分泌影響Fig.6 Effects of MoMFS2 deletion mutant on secretion of extracellular laccases and peroxidases

2.6 MoMFS2參與稻瘟病菌對不同殺菌劑的外排

為了進一步分析MoMfs2在稻瘟病菌外泌過程中的功能，利用4種防治稻瘟病主要殺菌劑咪鮮胺、嘧菌酯和多菌靈，將野生型、敲除突變體和互補轉(zhuǎn)化子分別接種到含有不同濃度的藥劑CM平板上，28 ℃、黑暗培養(yǎng)7 d后測量3個菌株的菌落直徑并且統(tǒng)計在不同濃度藥劑處理條件下的抑制率。結(jié)果(圖7)顯示MoMFS2敲除突變體在含有咪鮮胺、嘧菌酯和多菌靈的平板上生長抑制率上升。上述結(jié)果推測該基因參與了稻瘟病菌對殺菌劑的外排。

不同字母代表差異達0.05顯著水平Different letters represent significant difference of 0.05 level圖7 MoMFS2敲除突變體在不同殺菌劑條件下的抑制率Fig.7 Inhibition of MoMFS2 deletion mutant on various fungicide condition

2.7 MoMFS2基因敲除突變體致病性測定

為了分析MoMFS2基因?qū)Φ疚敛【a(chǎn)孢量、附著胞形成和致病性的影響，將野生型，敲除突變體和互補轉(zhuǎn)化子接種到產(chǎn)孢培養(yǎng)基(SDC)上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)孢量與野生型沒有差異，同時對其附著胞形成情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)附著胞形成率與野生型沒有差異(表3)。隨后將分生孢子調(diào)成濃度為5.0×104個/mL的孢子懸浮液(含0.2%明膠)，分別采用水稻噴霧和大麥離體點滴的方法進行致病性測定。結(jié)果顯示，敲除突變體在2種接種條件下，發(fā)病情況和野生型、互補轉(zhuǎn)化子均無差異；同時，還利用梯度稀釋方法在大麥葉片上進行了致病性測定，敲除突變體和野生型沒有明顯差異(圖8)。上述結(jié)果表明表明MoMFS2基因不參與在稻瘟病菌致病過程。

表3 MoMFS2敲除突變體分生孢子及附著胞形成Table 3 Conidiation morphogenesis and appressorium formation of the MoMFS2 detletion mutant

1：野生型菌株Guy11；2：敲除突變體ΔMomfs2；3：互補轉(zhuǎn)化子ΔMomfs2/MoMFS2。C1、C2、C3：孢子懸浮液濃度分別為5×102、5×103、5×104 個/mL1：Wild type strain Guy11; 2: The deletion mutant ΔMomfs2；3: The complementary mutant ΔMomfs2/MoMFS2.C1, C2, C3: The concentration of conidial suspension: 5×102、5×103、5×104 pcs/mL圖8 MoMFS2敲除突變體對水稻和大麥的致病性Fig.8 Pathogenicity of MoMFS2 deletion mutant on rice and barley

3 討 論

MFS轉(zhuǎn)運蛋白是一類非常古老、在各個物種中都起重要作用的轉(zhuǎn)運蛋白[6]，根據(jù)其序列相似性、功能特征和結(jié)構(gòu)特點分為85個家族。在稻瘟病菌中，共預測出251個MFS轉(zhuǎn)運蛋白，但至今只有一個蛋白的功能被報道。本研究利用基因敲除方法，發(fā)現(xiàn)一個MFS轉(zhuǎn)運蛋白MoMfs2參與了稻瘟病菌對物質(zhì)的分泌和殺菌劑的外排。

在稻瘟病菌中，含有MFS結(jié)構(gòu)域的MATE類蛋白家族Mdt1調(diào)控葡萄糖同化下游糖傳感器Tps1，同時Mdt1調(diào)控稻瘟病菌分生孢子產(chǎn)生和致病性[15]。在本研究中，MoMfs2轉(zhuǎn)運蛋白具有12次跨膜結(jié)構(gòu)，屬于典型的MFS轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)，但其不參與稻瘟病菌的分生孢子產(chǎn)生和致病性，參與了對胞外漆酶和過氧化物酶的分泌，對殺菌劑多菌靈、咪鮮胺和嘧菌酯的外排。胞外漆酶參與真菌色素合成、子實體形成和分生孢子形成、致病性等過程[16]；胞外過氧化物酶的分泌是植物病原真菌逃避寄主活性氧的重要途徑[17]。在本研究中，MoMfs2影響漆酶和過氧化物酶的分泌，但是對致病性沒有影響，推測主要是稻瘟病菌中MFS家族涉及多個成員，相互之間的功能出現(xiàn)冗余，其他的蛋白彌補了MoMfs2對胞外漆酶和過氧化物酶分泌的缺陷。

MFS轉(zhuǎn)運蛋白在多藥抗性方面發(fā)揮著重要作用。在白色念珠菌(Canidiaalbicans)中，MFS轉(zhuǎn)運蛋白MDR1和FLU1均對氟康唑具有顯著抗性[18]，且MDR1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域發(fā)揮了關(guān)鍵作用[19]。在鏈格孢(Alternariaalternata)中，MFS轉(zhuǎn)運蛋白AaMFS19可以對氧化脅迫和抗真菌藥劑產(chǎn)生抗性，且這種抗性受到Y(jié)ap1、Skn7等MAPK蛋白激酶調(diào)控[20]。在本研究中，MoMFS2敲除突變體對四種防治稻瘟病藥劑敏感性增強，也證實了MFS轉(zhuǎn)運蛋白參與了稻瘟病菌對殺菌劑的外排作用。

細胞壁完整性在真菌生長發(fā)育和對外界環(huán)境的耐受性發(fā)揮重要作用[4, 21]。在稻瘟病菌中，Mps1 MAPK信號通路主要參與對細胞壁完整性的調(diào)控。該信號通路上3個蛋白MoMck1、MoMps1和MoSwi6的缺失均導致細胞壁完整性缺陷[13, 22-23]。在本研究中，缺失MoMFS2導致稻瘟病菌原生質(zhì)體釋放速率變慢，同時對細胞壁脅迫剛果紅和SDS表現(xiàn)耐受性增強，推測該基因參與了稻瘟病菌的細胞壁完整性。從上文可知，部分MFS蛋白對藥劑的抗性受到MAPK蛋白激酶調(diào)控，那么細胞壁完整性與多藥抗性之間是否有相關(guān)性還需進一步深入研究。

4 結(jié) 論

本研究利用敲除的方法對MFS轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因MoMFS2的功能進行了研究，結(jié)果表明該基因參與調(diào)控稻瘟病菌細胞壁完整性和對殺菌劑的外排，上述結(jié)論加深了對稻瘟病菌抗藥性的認識，對稻瘟病的防控具有指導意義。