余興華，楊艷梅，李玉祥，陶永宏，孟凡來(lái)，滕 娟

(1.文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南 文山 663099；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明 650201)

【研究意義】八角茴香又稱八角、大料，是木蘭科八角屬植物，主產(chǎn)于中國(guó)的廣西、云南、貴州等省。八角具有濃郁的香氣，在增香矯味、腥膻味去除、鹵制品的制作等方面具有很好的調(diào)味作用[1]。同時(shí)具有藥用價(jià)值[2]，由于其味甘、性溫，具有開(kāi)胃理氣、暖腎散寒等功效，可用于治療寒疝腹痛、胃寒嘔吐、腎虛腰痛、脘腹冷痛等癥[3]。八角為二倍體(2n=28)[4]，在中國(guó)已有一千多年的栽培歷史，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇，其葉、花、果、樹(shù)形、分枝習(xí)性等方面具有明顯的差異，形成了眾多的類型和農(nóng)家品種，遺傳多樣性豐富[5]。目前，八角良種選育主要以優(yōu)樹(shù)選擇為主，依據(jù)表型、生物學(xué)特性等進(jìn)行評(píng)選，通過(guò)這種方式評(píng)選出的優(yōu)良單株易受環(huán)境影響、穩(wěn)定性差。【前人研究進(jìn)展】分子標(biāo)記技術(shù)是遺傳改良和種質(zhì)資源研究中一個(gè)有效的研究方法和輔助手段，孫雪陽(yáng)[6]利用AFLP分子標(biāo)記鑒別八角屬種質(zhì)資源；吳濤等[7]利用篩選出的13個(gè)ISSR引物分析八角居群內(nèi)和居群間遺傳多樣性與種質(zhì)資源鑒定；陳海云等[8]利用RAPD分子標(biāo)記研究了云南省八角的遺傳多樣性，但少有研究者應(yīng)用SSR標(biāo)記進(jìn)行八角分子生物學(xué)的相關(guān)研究。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat，SSR)又稱微衛(wèi)星標(biāo)記，分為基因組(Genormic-SSR)和表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tags-SSR, EST-SSR)標(biāo)記，從基因組序列和轉(zhuǎn)錄的RNA序列中鑒定出來(lái)[9]。其串聯(lián)重復(fù)序列包含1～6個(gè)核苷酸單元，具有多態(tài)性高、共顯性遺傳和重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，第二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的高通量、低成本、精確、高效的特點(diǎn)，可較好的用于發(fā)掘不同物種的綜合表達(dá)序列數(shù)據(jù)[10]。已在杜仲[11]、紅松[12]、山桐子[13]、枸杞[14]等物種上得到了較好的應(yīng)用。基于DNA測(cè)序儀的SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法，檢測(cè)效率高于銀染法，結(jié)果精確靈敏，在分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)[15]、基因分型[16]、種質(zhì)鑒定[17]等中得到很好的結(jié)合?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著研究的不斷深入，需要對(duì)八角進(jìn)行遺傳改良、種質(zhì)創(chuàng)新、遺傳多樣性評(píng)價(jià)等方面的系統(tǒng)研究，而八角SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)研究還缺乏?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組Illumina HiSeq4000 測(cè)序平臺(tái)測(cè)序獲得八角的SSRs數(shù)據(jù)，開(kāi)發(fā)其EST-SSR標(biāo)記，并對(duì)其特征、分布及組成進(jìn)行分析，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)出適用于八角的SSR分子標(biāo)記，為八角遺傳多樣性、種質(zhì)資源的挖掘利用、分子標(biāo)記輔助育種等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源

于2020年8月取云南省文山州西疇縣香坪山林場(chǎng)柔枝紅花八角的根、莖、葉、果4個(gè)部分組織，采集后用蒸餾水沖洗并擦干表面，然后立即放入液氮中凍結(jié)并轉(zhuǎn)存于-80 ℃保存?zhèn)溆?。樣品送往廣州基迪奧生物科技有限公司并利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)獲取八角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共得到44 267條Unigenes。

1.2 材料編號(hào)及DNA提取

用于SSR引物篩選的材料采自本課題組收集保存的8個(gè)單株，均為生產(chǎn)上的栽培種質(zhì)，2份來(lái)自廣西，6份來(lái)自文山，其花的顏色包含紅花和白花2種類型，柔枝紅花八角材料編號(hào)為：2020-303、2020-304、2020-215、2020-261、2020-307、2020-308；柔枝白花八角材料編號(hào)為2020-305和2020-306，其中2020-307、2020-308的種質(zhì)來(lái)源于廣西。在枝條的頂端，采集幼嫩葉并立即帶回實(shí)驗(yàn)室使用試劑盒TSINGKE提取植物DNA。

1.3 EST-SSR引物設(shè)計(jì)與篩選

在八角轉(zhuǎn)錄組數(shù)中，利用MISA(Microsatellite，http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)軟件進(jìn)行微衛(wèi)星的挖掘，參數(shù)設(shè)置為：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)類型的最少重復(fù)次數(shù)分別為6、5、4、4、4次；2個(gè)SSR 之間的距離最大為100 bp；運(yùn)用Primer3.0(http://www.broadinstitute.org/genome_software/other/primer3.html)在SSR位點(diǎn)的側(cè)翼進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，其主要參數(shù)為：每個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)3對(duì)引物；引物長(zhǎng)度18～27 bp；退火溫度(Tm)為57～63 ℃；GC含量為50%～60%；預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度100～300 bp；其它參數(shù)為默認(rèn)值。隨機(jī)挑選100對(duì)引物送昆明擎科生物科技有限公司合成，使用8份材料進(jìn)行引物篩選。PCR 擴(kuò)增體系為20 μL，其中金牌 Mix(green) 16.45 μL、Primer F(加接頭)0.15 μL、Primer R 1.2 μL、Tag (熒光：CAGTCGGGC GTCATCA)1.2 μL、DNA 1 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性2 min; 98 ℃變性10 s，58～60 ℃退火10 s，72 ℃ 10 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)膠圖確定模板濃度，加水稀釋到毛細(xì)管電泳所需濃度，上機(jī)到3730測(cè)序儀進(jìn)行毛線管電泳。隨后根據(jù)位點(diǎn)信息篩選出特異性高，多態(tài)性好的引物。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用Excel 2010進(jìn)行圖表的制作與統(tǒng)計(jì)，電泳結(jié)果通過(guò)Gene Mapper 4.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將有效峰轉(zhuǎn)化為0、1原始數(shù)據(jù)矩陣。應(yīng)用POPGENE Version 1.32軟件計(jì)算觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、香農(nóng)指數(shù)(I)、多態(tài)性信息指數(shù)(PIC)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)等SSR位點(diǎn)的遺傳多樣性指標(biāo)。用NTSYSpc Version 2.10軟件按照非加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析。平均距離=搜索序列總長(zhǎng)度/SSR個(gè)數(shù)；SSR出現(xiàn)頻率=搜索出的SSR個(gè)數(shù)/搜索序列數(shù)；SSR發(fā)生頻率=搜索出的含有SSR的序列數(shù)目/搜索序列數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 八角轉(zhuǎn)錄組序列中SSR的總體特點(diǎn)

通過(guò)對(duì)八角轉(zhuǎn)錄組的44 267條Unigenes序列進(jìn)行搜索(表1)，結(jié)果表明堿基序列總數(shù)為44 112 675 bp，發(fā)現(xiàn)其中6304條Unigenes序列中含有8210個(gè)SSR 位點(diǎn)，其中含1個(gè)EST-SSR 位點(diǎn)的Unigenes有4919條，比例為11.11%。含有2個(gè)或2個(gè)以上的EST-SSR 位點(diǎn)的Unigenes有1385 條，比例為3.13%。有923條Unigenes為復(fù)合SSR，比例為2.09%。Unigene出現(xiàn)頻率為18.55%，SSR 發(fā)生頻率為14.24%，平均每5.37 kb出現(xiàn)一個(gè)SSR。

表1 八角轉(zhuǎn)錄組中SSR分布情況Table 1 Distribution of SSR in Illicium verum transcriptomic sequences

2.2 八角轉(zhuǎn)錄組中SSR基序類型與頻率

八角轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星重復(fù)類型較為豐富，且檢出的各重復(fù)類型EST-SSR的數(shù)量相差較大。其中，二核苷酸重復(fù)數(shù)最多，為4206個(gè)，其次是三核苷酸，為3366個(gè)，四核苷酸為282個(gè)，五核苷酸為111個(gè)，六核苷酸為245個(gè)(圖1)。在二核苷酸中，AG/CT出現(xiàn)的頻率最高，為3779個(gè)，占比46.03%；其次是AC/GT(391個(gè)，占比4.76%)；接著是AT/AT(28個(gè)，占比0.34%)。三核苷酸主要有9種類型，AAG/CTT的占比最高(1361個(gè)，占比16.58%)；其次是ACC/GGT(636個(gè)，占比7.75%)；其它類型及占比依次為：ATC/ATG(5.36%)、AGC/CTG(4.14%)、AGG/CCT(2.18%)、AAC/GTT(2.18%)、CCG/CGG(1.69%)、ACG/CCT(0.54%)、ACT/AGT(0.34%)。四、五、六核苷酸的重復(fù)類型及占比相對(duì)較少，分別為282、111、245個(gè)，占比分別是3.43%、1.35%、2.98%。

圖1 八角轉(zhuǎn)錄組SSR基序類型分布特征Fig.1 Distribution characteristics of SSR motif types in the transcriptome of Illicium verum

2.3 八角轉(zhuǎn)錄組中SSR基序重復(fù)次數(shù)與長(zhǎng)度分布

在八角轉(zhuǎn)錄組中，SSR重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)為4～40次(圖2)，其中4次重復(fù)為473個(gè)，占比5.76%；5次重復(fù)數(shù)最多，為1854個(gè)，占比22.58%；再者是6次重復(fù)，為1628個(gè)，占比19.83%；7～14次重復(fù)及占比分別為：905個(gè)(11.02%)、644個(gè)(7.84%)、483個(gè)(5.88%)、311個(gè)(3.79%)、201個(gè)(2.45%)、184個(gè)(2.24%)、146個(gè)(1.78%)、234個(gè)(2.85%)?；虼笥?5次的重復(fù)較少，共占13.97%。八角轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星長(zhǎng)度分布為12～80 bp個(gè)堿基不等(圖3)，重復(fù)序列長(zhǎng)度12～15 bp的最多，為3070個(gè)(37.39%)；其次是長(zhǎng)度16～20 bp，為2146個(gè)(26.14%)；21～25 bp和26～30 bp分別為1160個(gè)(14.13%)、793個(gè)(9.66%)，大于31 bp的占比為12.68%。

圖2 八角轉(zhuǎn)錄組中SSR數(shù)量隨重復(fù)次數(shù)的變化Fig.2 Changes of the number of SSR with repeat times of motif in Illicium verum transcriptome

圖3 八角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中微衛(wèi)星的長(zhǎng)度分布Fig.3 Length distribution of microsatellites in Illicium verum transcriptome

2.4 EST-SSR 引物篩選及多態(tài)性分析

為了驗(yàn)證所設(shè)計(jì)引物標(biāo)記的可用性，隨機(jī)選擇100 對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，共篩選出16對(duì)多態(tài)性較高的引物(表2)。其篩選到的SSR重復(fù)基序以二重復(fù)為主，包含9對(duì)，其次三重復(fù)有5對(duì)，四重復(fù)有2對(duì)。8個(gè)樣本共檢測(cè)出80個(gè)等位基因位點(diǎn)，Na在3～8，平均值為5，引物IvSSR15最高；Ho為0.13(IvSSR39)～0.88(IvSSR33)，平均值為0.50；He為0.54(IvSSR77)～0.88(IvSSR9)，平均值為0.72；Ne和I數(shù)值變化范圍分別為2.03～5.82、0.83～1.84，平均值分別為3.44和1.34，Ne和I最高的引物是IvSSR5，最低的引物是IvSSR77。PIC除引物IvSSR77為0.43外，其余引物PIC均大于0.5，平均值為0.63，IvSSR5、IvSSR9、IvSSR15、IvSSR48具有較高的PIC值，呈現(xiàn)出較高的多態(tài)性信息。圖4為部分八角種質(zhì)IvSSR9引物的SSR 位點(diǎn)基因型，呈現(xiàn)出在不同位點(diǎn)的基因型差異。

圖4 4份八角種質(zhì)IvSSR9的SSR 位點(diǎn)基因型Fig.4 IvSSR9 SSR locus genotypes of 4 Illicium verum germplasm

表2 16 對(duì)EST-SSR引物在8份八角種質(zhì)中的特征Table 2 Genetic characteristics of 8 Illicium verum germplasm as revealed by 16 pairs of EST-SSR primers

2.5 基于EST-SSR 標(biāo)記的遺傳關(guān)系分析

基于16對(duì)多態(tài)性SSR引物分析8個(gè)樣本的遺傳關(guān)系(圖5)，UPGMA聚類圖總體上呈現(xiàn)出白花類型與紅花類型八角的分類，2個(gè)白花類型八角2020-305、2020-306的親緣關(guān)系較近，相似系數(shù)為0.825，與其它紅花類型的八角親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。紅花類型的八角單株間同樣具有不同的遺傳關(guān)系，其遺傳距離為0.525～0.713，2020-303與2020-305、2020-306的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明八角不同花色種質(zhì)間的親緣關(guān)系存在差異。不同地理來(lái)源之間的八角種質(zhì)并未形成明顯的差異，這可能與八角種質(zhì)的交流有關(guān)，文山與廣西相鄰，文山種植的八角普遍由廣西引進(jìn)，兩地種質(zhì)間的親緣關(guān)系自然較為相近。因此，應(yīng)用開(kāi)發(fā)的SSR分子標(biāo)記判斷種質(zhì)遺傳關(guān)系可為八角遺傳多樣性、育種改良等提供依據(jù)。

圖5 基于SSR標(biāo)記的8份八角種質(zhì)聚類Fig.5 Cluster of 8 Illicium verum varieties based on SSR markers

3 討 論

3.1 八角EST序列中SSR的特征

本研究基于八角轉(zhuǎn)錄組的44 267條Unigenes展開(kāi)SSR 分析和引物開(kāi)發(fā)，發(fā)現(xiàn)含有SSR 位點(diǎn)標(biāo)記的序列數(shù)量有6304個(gè)，發(fā)生頻率為14.24%，平均每5.37 kb出現(xiàn)一個(gè)SSR位點(diǎn)。在不同物種間EST-SSR的發(fā)生頻率存在很大的差異[18]，馬尾松4.69%[19]、荔枝16.53%[20]、刺梨20.37%[21]。這與SSR的估計(jì)頻率、數(shù)據(jù)庫(kù)的大小、SSR搜索標(biāo)準(zhǔn)及使用的挖掘工具有關(guān)[18]。研究者對(duì)不同物種EST-SSR的重復(fù)基序分析指出不同植物的主要重復(fù)類型不一樣，但二核苷酸和三核苷酸是最常見(jiàn)的EST-SSR重復(fù)基序類型[22]，二核苷酸重復(fù)數(shù)量較多的物種是桃子[23]、橡膠[24]、紅松[12]、水杉[25]、杜仲[11]等。三核苷酸重復(fù)數(shù)量較多的物種是柑橘[26]、杉木[27]、文冠果[28]等。八角EST-SSR結(jié)構(gòu)中，二核苷酸重復(fù)數(shù)最多，為4206個(gè)，占比26.70%；其次是三核苷酸，為3366個(gè)，占比21.37%。二核苷酸中AG/CT出現(xiàn)的頻率最高，占比為46.03%，其二核苷酸類型與火龍果[29]、草莓[30]、獼猴桃[31]研究結(jié)果一致。AG/CT可能與丙氨酸和亮氨酸的密碼子CUC和UCU關(guān)系密切，也是蛋白中最為常見(jiàn)的2種氨基酸[32]。植物中，較常見(jiàn)的三堿基重復(fù)是AAG[33]，在識(shí)別出八角EST-SSR位點(diǎn)中，三核苷酸中AAG/CTT重復(fù)基元豐富，有1361個(gè)，發(fā)生頻率為16.58%，與胡椒[34]、刺梨[21]、水松[35]研究認(rèn)為三核苷酸中主要重復(fù)類型是AAG/CTT 的結(jié)論相一致。二核苷酸中AG/CT重復(fù)基序占優(yōu)勢(shì)，三核苷酸中AAG/CTT重復(fù)基序占優(yōu)勢(shì)，這與雙子葉植物中AAG/CTT重復(fù)基序占優(yōu)勢(shì)的規(guī)律相符合[36]。

3.2 引物的篩選及遺傳多樣性

本研究從100對(duì)SSR引物中僅篩選出16對(duì)多態(tài)性、穩(wěn)定性好的SSR引物，占引物總數(shù)的16%，包含二、三、四核苷酸，以二、三核苷酸重復(fù)的低級(jí)單元序列為主，呈現(xiàn)出低級(jí)單元大于高級(jí)單元SSR的多態(tài)性，這與Dreisigacker等[37]研究結(jié)果一致，因此在篩選SSR引物時(shí)應(yīng)側(cè)重于含低級(jí)單元的重復(fù)基序。引物平均PIC為0.63，它的大小反映等位基因的數(shù)量與分布頻率[38]，可作為檢測(cè)引物多態(tài)性能力的一種度量指標(biāo)。PIC 值大于0.5，代表位點(diǎn)具有高度多態(tài)性，基因變異程度大；在0.25～0.50,代表位點(diǎn)具有中度多態(tài)性，基因變異程度一般；PIC 值小于0.25 時(shí)代表位點(diǎn)具有低多態(tài)性，基因變異程度不明顯[39]。本研究中除IvSSR77的PIC為0.43外，其余15對(duì)引物均大于0.5，其中IvSSR5、IvSSR9、IvSSR15、IvSSR33、IvSSR48、IvSSR55、IvSSR66的Na和PIC值相對(duì)較高，具有高度的多態(tài)性，可為核心引物。SSR標(biāo)記在屬內(nèi)種間乃至屬間的基因組具有一定的通用性[40-41]，全世界八角屬植物約50種，中國(guó)約有30個(gè)種[42]，應(yīng)用高通量測(cè)序開(kāi)發(fā)的八角EST-SSR引物可為近緣屬種鑒定、遺傳多樣性評(píng)價(jià)、分子標(biāo)記輔助育種等提供依據(jù)。8個(gè)樣本的親緣關(guān)系表明白花八角與紅花八角具有不同的遺傳距離，紅花類型的單株間同樣具有不同的遺傳關(guān)系，表明不用優(yōu)良單株具有較高的遺傳多樣性和廣泛的遺傳基礎(chǔ)。若需要了解更多八角的遺傳信息和遺傳關(guān)系，還需選取更多的試驗(yàn)材料和SSR標(biāo)記。

3.3 關(guān)于SSR標(biāo)記的檢測(cè)方法

SSR標(biāo)記檢測(cè)法常用瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺電泳法和毛細(xì)管熒光電泳法，瓊脂糖凝膠電泳法分離結(jié)果不理想，聚丙烯酰胺電泳法需要經(jīng)過(guò)電泳和銀染2個(gè)步驟，過(guò)程繁瑣，且易產(chǎn)生雜帶的干擾。熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法是以DNA 測(cè)序儀為平臺(tái)，具有所需樣量少，精確度、靈敏度高，自動(dòng)化的特點(diǎn)[16]。本研究采用ABI3730 DNA分析儀對(duì)100對(duì)熒光SSR引物擴(kuò)增、篩選與分析，試驗(yàn)結(jié)果更加客觀。

4 結(jié) 論

本研究將八角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的44 267條Unigene進(jìn)行了簡(jiǎn)單重復(fù)序列位點(diǎn)挖掘，共獲得8210個(gè)SSR位點(diǎn)，發(fā)生頻率為14.24%。SSR位點(diǎn)中二、三核苷酸重復(fù)類型占主導(dǎo)地位，二核苷酸中AG/CT出現(xiàn)的頻率最高,三核苷酸中AAG/CTT出現(xiàn)的頻率最高。不同SSR的重復(fù)次數(shù)為4～40次，長(zhǎng)度分布為12～80 bp。隨機(jī)選擇100對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，共篩選出16對(duì)多態(tài)性較高的引物，引物以二重復(fù)基序?yàn)橹?。運(yùn)用篩選到的多態(tài)性引物分析優(yōu)良單株間的遺傳關(guān)系，初步驗(yàn)證了SSR位點(diǎn)在八角標(biāo)記中的可行性。開(kāi)發(fā)的EST-SSR引物可為八角遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種等奠定基礎(chǔ)。