叢蓓蓓,徐穎婕,高美華,于習(xí)習(xí),王萬春,王芳

(青島市口腔醫(yī)院,山東 青島 266001 1 中心實(shí)驗(yàn)室； 2 口腔黏膜科； 3 藥劑科)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)目前是全球第六大常見惡性腫瘤，在癌癥相關(guān)死亡率中排名第八[1]。OSCC的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括大量遺傳和表觀遺傳癌基因的積累和抑制基因的丟失，導(dǎo)致多種信號(hào)通路失調(diào)，從而破壞細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡之間的平衡[2]。即使采取了外科手術(shù)結(jié)合放療和(或)化療的治療方式，OSCC病人的5年生存率也仍保持在50%～60%[3]。雖然臨床和實(shí)驗(yàn)室研究表明，OSCC細(xì)胞已經(jīng)對(duì)臨床化療藥物產(chǎn)生了耐藥性[4]，但是，上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變需要經(jīng)歷很長的時(shí)間，包括多種細(xì)胞和基因的改變，故藥物干預(yù)是癌癥轉(zhuǎn)化之前的最佳手段。阿司匹林是一種眾所周知的非甾體抗炎藥，常用于預(yù)防反復(fù)發(fā)作的短暫性腦缺血或卒中[5]。除了其經(jīng)典的抗炎功能之外，臨床和流行病學(xué)研究表明，阿司匹林可用于多種癌癥的預(yù)防或治療[6-8]。研究揭示阿司匹林在結(jié)直腸癌的化療預(yù)防中起重要的作用[9-12]，但仍需對(duì)其他的癌癥，包括口腔癌，進(jìn)行多項(xiàng)低劑量阿司匹林治療的試驗(yàn)，從而明確其具體的作用機(jī)制及最佳化學(xué)預(yù)防劑量。本研究探討不同濃度的阿司匹林對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞SCC-9生長的影響，并檢測SCC-9細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等指標(biāo)。旨在為阿司匹林輔助治療OSCC提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，增加對(duì)口腔鱗癌發(fā)病機(jī)制的了解。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人鱗癌細(xì)胞系SCC-9購自浙江美森細(xì)胞科技有限公司。胎牛血清購于依科賽生物科技有限公司(上海，中國)。DMEM培養(yǎng)液購于Hyclone公司(猶他州洛根，美國)。阿司匹林原料藥、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、甲基噻唑基四唑(MTT)細(xì)胞增殖和毒性測定試劑盒、β-actin一抗和HRP標(biāo)記的二抗均購自索萊寶生物有限公司(北京，中國)。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)試劑盒和Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購于碧云天生物有限公司(上海，中國)。Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自艾科瑞生物工程有限公司(長沙，中國)。抗人Bcl-2一抗、Bax一抗均購自圣克魯斯生物技術(shù)公司(得克薩斯州達(dá)拉斯，美國)。ECL發(fā)光試劑購自賽默飛世爾科技公司(馬薩諸塞州沃爾瑟姆，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 SCC-9細(xì)胞使用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清及體積分?jǐn)?shù)0.01青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，用2.5 g/L的胰蛋白酶(含EDTA)消化細(xì)胞，每2～3 d傳代或更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次。取對(duì)數(shù)期生長的SCC-9細(xì)胞培養(yǎng)過夜，分為A、B、C、D、E、F組，分別加入含不同濃度(0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L)阿司匹林的培養(yǎng)液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT法檢測細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)期生長的SCC-9細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞(體系100 μL)。按照1.2.1方法分組處理，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后檢測細(xì)胞增殖變化。棄去含藥培養(yǎng)液，加入90 μL新鮮培養(yǎng)液及10 μL的MTT后繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去培養(yǎng)液，每孔再加入110 μL的Formazan溶液，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上振蕩約10 min，測定490 nm波長處吸光度值。

1.2.3平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力取對(duì)數(shù)期生長的SCC-9細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1×103個(gè)細(xì)胞(體系1 mL)。按照1.2.1方法分組處理，培養(yǎng)48 h后，棄去含藥培養(yǎng)液，更換為正常DMEM培養(yǎng)液。置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3周左右。期間觀察、換液，當(dāng)6孔板內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄上清，PBS工作液浸洗2次，加入40 g/L多聚甲醛溶液固定15 min。去除固定液，加入1 g/L結(jié)晶紫室溫染色5 min，流水清洗染色液，干燥，拍照。通過Image J圖像分析軟件計(jì)算克隆數(shù)。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)期生長的SCC-9細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞(體系1 mL)。按照1.2.1方法分組處理，培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS清洗2次。用195 μL的Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液避光孵育20 min。使用DxFLEX流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡率檢測，并分析結(jié)果。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測Bcl-2和BaxmRNA表達(dá) 取對(duì)數(shù)期生長的SCC-9細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。按照1.2.1方法分組處理培養(yǎng)24 h后，加入Trizol試劑提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)5次。由PCR反應(yīng)曲線得到域值循環(huán)數(shù)(Ct)，以GAPDH作為內(nèi)參照，采用一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析SCC-9細(xì)胞中Bcl-2、Bax基因的表達(dá)水平。所用引物及其序列見表1。

表1 PCR引物及其序列

1.2.6Western blot法檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)期生長的SCC-9細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。按照1.2.1方法分組處理培養(yǎng)24 h后提取總蛋白，使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度，置于120 g/L的SDS-PAGE凝膠上電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，膜在室溫下用50 g/L脫脂牛奶封閉2 h，并在4 ℃下與一抗孵育過夜。TBST沖洗3次后加入HRP標(biāo)記的二抗室溫振蕩孵育2 h，TBST沖洗，使用ECL試劑和Fluor Chem Q凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)印跡的膜進(jìn)行曝光和分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度阿司匹林對(duì)SCC-9細(xì)胞生長影響

與對(duì)照組相比較，經(jīng)低濃度阿司匹林(1.25、2.50 mmol/L)處理的SCC-9細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞呈多邊形或是長梭形，細(xì)胞邊緣飽滿，偶可見皺縮細(xì)胞；5.00 mmol/L阿司匹林處理組與對(duì)照組相比，細(xì)胞仍可保持原有的形態(tài)，但飽滿程度較差，皺縮細(xì)胞增多；高濃度阿司匹林(10.00、20.00 mmol/L)處理后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，細(xì)胞皺縮變形，細(xì)胞間隙明顯變寬。見圖1。

A、B、C、D、E、F組的阿司匹林濃度分別為0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L。

2.2 不同濃度阿司匹林對(duì)SCC-9細(xì)胞增殖活力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L阿司匹林對(duì)SCC-9細(xì)胞增殖抑制作用越來越顯著。阿司匹林濃度達(dá)到5.00 mmol/L時(shí)，SCC-9增殖受到抑制，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.31，P<0.05)；高濃度阿司匹林(10.00、20.00 mmol/L)顯著影響SCC-9細(xì)胞的增殖，與對(duì)照組相比差異具有顯著性(P<0.001)。見圖2。

2.3 不同濃度阿司匹林對(duì)SCC-9細(xì)胞克隆能力的影響

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，接種貼壁細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量，直接反映細(xì)胞群體的依賴性及增殖能力。與對(duì)照組相比，隨著阿司匹林濃度的升高，SCC-9細(xì)胞克隆數(shù)逐漸降低。5.00、10.00 mmol/L阿司匹林處理SCC-9細(xì)胞時(shí)，克隆形成率下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=59.68，P<0.05)；當(dāng)阿司匹林達(dá)到20.00 mmol/L時(shí)顯著影響SCC-9細(xì)胞的增殖，差異具有顯著性(P<0.001)。見圖3。

A、B、C、D、E、F組的阿司匹林濃度分別為0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L。與對(duì)照組比較,*P<0.05,***P<0.001。

2.4 不同濃度阿司匹林對(duì)SCC-9細(xì)胞凋亡影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，不同濃度阿司匹林作用SCC-9細(xì)胞后凋亡均有增加，而且與阿司匹林濃度增加程度呈正比。當(dāng)阿司匹林濃度為2.50、5.00 mmol/L時(shí)細(xì)胞凋亡數(shù)即有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=816.00，P<0.05)；當(dāng)阿司匹林的濃度達(dá)到10.00、20.00 mmol/L后細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加，差異具有顯著性(P<0.001)。見圖4。

2.5 不同濃度阿司匹林對(duì)SCC-9細(xì)胞Bcl-2和Bax基因及其蛋白表達(dá)影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot方法檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Bcl-2基因和蛋白表達(dá)水平隨阿司匹林濃度升高而降低，Bax反之。與對(duì)照組相比，當(dāng)阿司匹林濃度為2.50 mmol/L時(shí)Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=215.90、9 473.00，P<0.05)；當(dāng)濃度達(dá)到5.00、10.00、20.00 mmol/L時(shí)其表達(dá)水平明顯降低，差異均具有顯著意義(P<0.001)；阿司匹林濃度為5.00、10.00、20.00 mmol/L時(shí)BaxmRNA和蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 388.00、4 345.00，P<0.001)。見表2和圖5。

3 討 論

口腔頜面部腫瘤是一種常見的惡性腫瘤，伴隨著腫瘤多藥耐藥這一難題的出現(xiàn)，全球口腔癌生存率并沒有明顯改善，因此開發(fā)新型、高效、低毒的抗口腔頜面部腫瘤藥物迫在眉睫[2]。阿司匹林(乙酰水楊酸)是最古老的合成藥物，作為產(chǎn)生前列腺素和血栓素前體的COX(前列腺素內(nèi)過氧化物合酶)酶的不可逆抑制劑，逐漸發(fā)現(xiàn)了阿司匹林除抗炎藥的其他幾種應(yīng)用。阿司匹林作為一種癌癥化學(xué)預(yù)防劑和癌癥標(biāo)志物的主要調(diào)節(jié)劑，其攝入可用于降低結(jié)直腸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[13]，也可以抑制腫瘤細(xì)胞本身的生物活性，并干擾支持腫瘤生長的微環(huán)境[14]。研究表明，阿司匹林在預(yù)防癌癥，特別是在結(jié)直腸癌方面具有強(qiáng)大的潛力[9,12]。本文以口腔鱗癌SCC-9細(xì)胞為研究對(duì)象，初步探索阿司匹林對(duì)人口腔頜面部惡性腫瘤的抑制作用。

A、B、C、D、E、F組的阿司匹林濃度分別為0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L。與對(duì)照組比較,*P<0.05,***P<0.001。

A、B、C、D、E、F組的阿司匹林濃度分別為0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L。與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

表2 不同濃度阿司匹林對(duì)SCC-9細(xì)胞Bcl-2和Bax mRNA及其蛋白表達(dá)影響

A、B、C、D、E、F組的阿司匹林濃度分別為0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L。

本文研究結(jié)果顯示，在低濃度阿司匹林(1.25、2.50 mmol/L)下SCC-9細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞飽滿；濃度達(dá)到5.00 mmol/L后，隨濃度上升，細(xì)胞形態(tài)改變，胞膜皺縮，細(xì)胞間隙變寬。MTT及克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)阿司匹林濃度高于5.00 mmol/L時(shí)，明顯抑制SCC-9細(xì)胞的增殖活力?？梢?，阿司匹林對(duì)SCC-9細(xì)胞抑制增殖的作用呈濃度依賴性。大量研究結(jié)果表明，阿司匹林可降低結(jié)直腸、食管、乳房、肺臟等器官的患癌風(fēng)險(xiǎn)[13-15]，但長期服用阿司匹林可以加重病人胃腸道潰瘍及出血的風(fēng)險(xiǎn)。因此，尋找阿司匹林最佳的化學(xué)預(yù)防劑量至關(guān)重要。2.50 mmol/L阿司匹林可抑制乳癌SKBR3細(xì)胞的遷移和侵襲能力[16]；5.00 mmol/L阿司匹林即可引起宮頸癌Hela細(xì)胞基因組DNA變化[17]。本研究中，阿司匹林達(dá)到5.00 mmol/L以上對(duì)OSCC細(xì)胞出現(xiàn)明顯的抑瘤作用。

目前阿司匹林的抗腫瘤機(jī)制尚不明確，可能與其通過抑制COX-2酶的活性發(fā)揮抑瘤作用有關(guān)。在腫瘤發(fā)生過程中，COX-2被誘導(dǎo)并進(jìn)一步增加PGE2的產(chǎn)生，破壞細(xì)胞正常的凋亡過程，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖失調(diào)[18]。已有研究表明，阿司匹林可能通過蛋白磷酸酶2A(PP2A)失活減少β-連環(huán)蛋白的細(xì)胞質(zhì)池而降低結(jié)腸癌病人的發(fā)病率[19]；通過抑制NF-κB通路抑制骨肉瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并增加骨肉瘤對(duì)體外和體內(nèi)化療的敏感性；通過調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的活性和表達(dá)，包括半胱天冬酶、Bcl-2、Bax和VEGF等，抑制人骨髓瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡；通過抑制丙酮酸脫氫酶激酶1(PDK1)介導(dǎo)的腫瘤干細(xì)胞(CSC)調(diào)節(jié)機(jī)制為侵襲性乳癌提供潛在的治療機(jī)會(huì)[20-22]。本研究結(jié)果表明，阿司匹林可以促進(jìn)SCC-9細(xì)胞的凋亡，且促進(jìn)凋亡作用與藥物濃度呈正相關(guān)。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡與存活的一個(gè)重要控制器。本研究結(jié)果顯示，阿司匹林各濃度組中促凋亡蛋白Bax在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上顯著上升，而抑凋亡蛋白Bcl-2則相反。因此，我們認(rèn)為阿司匹林可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞SCC-9增殖，并且藥物濃度越高其作用越強(qiáng)。

綜上所述，該研究主要驗(yàn)證了阿司匹林在口腔鱗癌細(xì)胞的抗腫瘤作用，為阿司匹林的抗腫瘤作用提供了一定的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。但本研究仍存在不足之處，在口腔鱗癌細(xì)胞中阿司匹林通過何種信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡尚缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)，因此，后續(xù)將進(jìn)一步探討其抑制口腔鱗癌細(xì)胞的分子調(diào)控機(jī)制，為口腔鱗癌化學(xué)治療提供新的依據(jù)與策略。