廖潔梅,肖寶紅,郭彩宏,鞏秀珍,程兆忠,林存智

(青島大學,山東 青島 266003 1 附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科； 2 醫(yī)學院松山醫(yī)院綜合內(nèi)科)

肺癌是全球發(fā)病率及死亡率均居首位的惡性腫瘤，是癌癥病人死亡的主要原因[1]。肺癌按照其病理類型可以分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)兩大類，其中SCLC約占所有肺癌的15%[2]。SCLC惡性程度高、侵襲性強，早期即可出現(xiàn)血行轉(zhuǎn)移，未進行任何積極治療的病人，其5年生存率低于5%，平均總生存期僅為2～4個月[3-4]。多數(shù)SCLC病人在確診時已是晚期，失去了手術治療的最佳時機，放化療成為主要治療手段。盡管SCLC對放化療敏感，但經(jīng)過一段時間的治療后部分病人會出現(xiàn)耐藥及腫瘤的擴散，伴隨著不可避免的嚴重副作用[5]。血卟啉衍生物(HPD)介導的光動力療法(PDT)是一種溫和、相對安全的局部治療方法，因具有可選擇性殺傷腫瘤細胞、創(chuàng)傷小等特點，PDT在癌癥精準治療方面展現(xiàn)了獨特的治療優(yōu)勢，是目前惡性腫瘤輔助治療的新方法。研究表明，PDT對皮膚腫瘤、頭頸部腫瘤、基底細胞癌、乳癌、前列腺癌、結腸癌、膀胱癌等均有治療作用[6-9]。但目前關于PDT對SCLC作用的研究甚少，其效果及機制需要進一步的研究，且SCLC的總體生存率低，探索新的治療方法顯得尤為重要。本實驗旨在探討不同光敏劑濃度及不同功率密度的630 nm激光照射對人SCLC H446細胞的體外殺傷效應及其作用機制，以期為肺癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株與主要試劑 人SCLC H446細胞，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。HPD購自重慶華鼎現(xiàn)代生物制藥公司，細胞培養(yǎng)液DMEM購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自以色列Biolo-gical Industries公司，CCK8試劑盒購自美國MedChemExpress公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量試劑盒均購自日本TaKaRa公司，Hoechst 33258染色液購自北京索萊寶科技有限公司，AnnexinV-FITC和PI凋亡檢測試劑盒購自上海愛必信生物有限公司。

1.1.2儀器 實驗所用的LED-IB光動力治療儀，由武漢亞格光電技術有限公司生產(chǎn)，輸出波長為紅光(633±10)nm、藍光(417±10)nm、黃光(590±10)nm，輸出功率密度為紅光20～100 mW/cm2、藍光25～120 mW/cm2、黃光10～40 mW/cm2，工作方式為連續(xù)或脈沖。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) H446細胞常規(guī)用含100 kU/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素混合液、體積分數(shù)0.10滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換1次培養(yǎng)液，待細胞密度增長至70%～80%時，常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2CCK8法檢測細胞活力 將H446細胞接種于5塊96孔板中，每組設置3個復孔，培養(yǎng)至貼壁后進行實驗。分別加入HPD濃度為0、5、10、12、15、20 mg/L的培養(yǎng)液避光培養(yǎng)4 h后更換含體積分數(shù)0.10胎牛血清的培養(yǎng)液，分別給予0、25、50、75、100 mW/cm2功率密度的630 nm激光垂直照射2 min，垂直距離9 cm，光斑直徑9 cm。培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，加入100 μL含體積分數(shù)0.10 CCK8的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用自動酶標儀于450 nm波長處檢測各組細胞吸光度(A)值，計算細胞活力：細胞活力=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。實驗重復3次。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡 選取CCK8實驗中篩選出來的最佳HPD-PDT參數(shù)進行后續(xù)實驗。實驗設空白對照組(無光敏劑，無激光照射)、單純光敏劑組(光敏劑濃度為15 mg/L，無激光照射)、單純光照組(無光敏劑，激光功率密度為50 mW/cm2)和HPD-PDT組(光敏劑濃度為15 mg/L，激光功率密度為50 mW/cm2)。經(jīng)上述處理24 h后收集細胞，調(diào)整至密度為109/L，離心后以PBS洗2次，加入500 μL Binding buffer重懸細胞，按要求依次加入AnnexinV-FITC和PI染色劑各5 μL，室溫避光孵育5～15 min，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.2.4Hoechst 33258染色檢測細胞凋亡 取潔凈細胞爬片，用體積分數(shù)0.75乙醇浸泡10 min、PBS洗3次、培養(yǎng)液洗1次后置于12孔板內(nèi)，接種H446細胞后培養(yǎng)過夜。細胞貼壁后隨機分為空白對照組(無光敏劑，無激光照射)、單純光敏劑組(光敏劑濃度為15 mg/L，無激光照射)、單純光照組(無光敏劑，激光功率密度為50 mW/cm2)和HPD-PDT組(光敏劑濃度為0、5、10、12、15、20 mg/L，激光功率密度為50 mW/cm2)。進行相應處理避光培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入0.5 mL固定液，15 min后棄固定液并用PBS洗3次，每孔加入0.5 mL Hoechst 33258染色液染色5 min，棄染色液，以PBS洗3次，將一滴抗熒光猝滅劑滴在載玻片上，蓋上染色好的細胞爬片，室溫避光孵育15 min后于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測Bax、Bcl-2、Caspase-9mRNA的表達水平 分組及處理方法同1.2.4。處理24 h后每孔加入TRIzol 1 mL，靜置5 min 后轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，加入三氯甲烷0.2 mL，振蕩混勻后離心；吸取上清至新的EP管中，加入與其等量的異丙醇；離心后棄上清，加入無水乙醇0.5 mL；離心后棄乙醇，檢測所提取的RNA濃度。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作獲得cDNA，根據(jù)SYBR Green熒光定量試劑盒說明以此cDNA為模板進行目的片段擴增，計算各組基因相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 HPD-PDT對H446細胞活力的影響

不同HPD濃度和光照強度下各組細胞存活率比較，光敏劑濃度(F=1 269.533,P<0.001)和激光功率密度(F=1 229.600,P<0.001)主效應均有統(tǒng)計學意義，且二者存在交互效應(F=78.430，P<0.001)。單獨給予光敏劑或者激光照射對H446細胞無明顯殺傷作用；HPD-PDT對H446細胞殺傷效應隨著光敏劑濃度的增加和激光功率密度的增大而增大，當激光功率密度為50、75、100 mW/cm2以及光敏劑濃度為15、20 mg/L時，細胞存活率明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(F=663.385～807.743,P<0.001)。當激光功率密度為50 mW/cm2、HPD濃度為15 mg/L時，HPD-PDT對細胞的殺傷效應明顯，再增加激光功率密度或者光敏劑濃度細胞存活率無顯著變化(t=0.480～1.946，P>0.05)。因此，選取激光功率密度為50 mW/cm2和HPD濃度為15 mg/L進行后續(xù)實驗。見圖1。

2.2 HPD-PDT對H446細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測顯示，空白對照組、單純光敏劑組、單純光照組和HPD-PDT組的細胞凋亡率分別為(8.60±1.22)%、(11.99±0.21)%、(10.17±0.58)%和(59.67±2.36)%，4組整體比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=2 073.518，P<0.001)，HPD-PDT組與空白對照組、單純光敏劑組和單純光照組相比細胞凋亡率明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學意義(t=62.612～65.612，P<0.001)。Hoechst 33258染色顯示，空白對照組、單純光敏劑組和單純光照組無明顯細胞凋亡，HPD-PDT組可見凋亡細胞染色質(zhì)固縮，細胞核致密濃染，隨著光敏劑濃度的增加，凋亡細胞增多且細胞密度降低。見圖2、3。

2.3 HPD-PDT對H446細胞Caspase-9、Bax及Bcl-2 mRNA表達的影響

RT-PCR檢測結果顯示，與各對照組相比較，HPD-PDT組H446細胞的Bax、Caspase-9mRNA的表達水平明顯上調(diào)(F=445.426、1 765.177，P<0.05)，而Bcl-2mRNA表達水平則明顯下調(diào)(F=171.193，P<0.05)。見圖4。

圖1 不同濃度HPD結合不同功率密度激光照射對H446細胞活力的影響

3 討 論

PDT是近年來腫瘤治療領域的一種新型微創(chuàng)技術，該技術利用腫瘤組織對光敏劑選擇性攝入和濃集的特性，給予特定波長激光照射，激發(fā)腫瘤組織中的光敏劑產(chǎn)生活性氧，從而導致腫瘤細胞發(fā)生凋亡、壞死及自噬等一系列過程，最終達到治療的目的[6,10]。光敏劑在正常組織中能迅速代謝，因此在殺死腫瘤細胞的同時對正常細胞的損傷較小，不會產(chǎn)生嚴重副作用，PDT因為靶向性強、微創(chuàng)、可重復進行多次治療等優(yōu)點逐漸成為癌癥治療的新手段。其抗腫瘤機制主要有如下幾點。①光敏劑吸收特定波長的光后發(fā)生Ⅰ型和Ⅱ型光化學反應，Ⅰ型光化學反應即三重態(tài)光敏劑與底物分子間直接發(fā)生電子轉(zhuǎn)移或抽氫作用，產(chǎn)生自由基離子，并進一步與周圍的氧反應生成活性氧；Ⅱ型光化學反應即三重態(tài)光敏劑轉(zhuǎn)移能量至基態(tài)氧，產(chǎn)生單態(tài)性氧。這些物質(zhì)與腫瘤細胞中的分子發(fā)生氧化反應，最終導致細胞凋亡或壞死[11]。②PDT通過改變新生血管內(nèi)皮細胞的功能結構，導致新生血管血供減少，從而使之缺血、低氧而變性壞死，抗新生血管生成。③增強腫瘤免疫原性，激發(fā)機體免疫反應[10]。本研究結果顯示，HPD-PDT處理后人SCLC H446細胞的存活率明顯降低，其殺傷效應與HPD濃度和激光照射劑量密切相關，在一定范圍內(nèi)，隨著光敏劑濃度和激光功率密度的增加而增大。

A：空白對照組；B：單純光敏劑組；C：單純光照組；D：HPD-PDT 組。

A：空白對照組；B：單純光敏劑組；C：單純光照組；D：HPD-PDT組(HPD為5 mg/L)；E：HPD-PDT組(HPD為10 mg/L)；F：HPD-PDT組(HPD為12 mg/L)；G：HPD-PDT組(HPD為15 mg/L)；H：HPD-PDT組(HPD為20 mg/L)。200倍。

A：空白對照組；B：單純光敏劑組；C：單純光照組；D：HPD-PDT組(HPD為5 mg/L)；E：HPD-PDT組(HPD為10 mg/L)；F：HPD-PDT組(HPD為12 mg/L)；G：HPD-PDT組(HPD為15 mg/L)；H：HPD-PDT組(HPD為20 mg/L)。

Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡途徑的關鍵調(diào)控因子，可分為凋亡促進因子和凋亡抑制因子，兩者的比值決定細胞是否能接受凋亡信號[12]。Bcl-2屬于抗凋亡因子，Bax屬于促凋亡因子，Bax通過與自身組成同源二聚體或者與Bcl-2組成異源二聚體，抑制Bcl-2的活性，從而發(fā)揮促進細胞凋亡的作用[13-14]。本研究結果顯示，HPD-PDT處理后的H446細胞Bcl-2mRNA表達水平明顯降低，而BaxmRNA表達水平明顯升高，提示HPD-PDT可能通過改變Bax和Bcl-2異源二聚體平衡而誘導細胞凋亡，與GUO等[15]的研究結果(PDT導致Bcl-2表達水平下調(diào)、Bax表達水平上調(diào))一致。Caspase家族是執(zhí)行細胞凋亡的關鍵酶家族，其成員為存在于胞質(zhì)溶膠中的半胱氨酸蛋白酶，可以選擇性地對多種信號轉(zhuǎn)導途徑中的蛋白質(zhì)進行高效切割[16]。Caspase-9是內(nèi)源性凋亡途徑中的關鍵蛋白酶，Bcl-2家族成員Bax和Bak的激活導致細胞色素C(Cyt C)等促凋亡蛋白的釋放[17-18]，Cyt C結合Apaf-1形成凋亡小體并激活Caspase-9，活化的Caspase-9可以直接裂解并激活Caspase-3和Caspase-7，從而加速細胞凋亡[19-21]。本研究中H446細胞經(jīng)HPD-PDT處理后BaxmRNA表達增加，Bcl-2mRNA表達降低，啟動Caspase級聯(lián)反應，Caspase-9活化并激活下游Caspase-3和Caspase-7，完成對底物的切割，誘導細胞凋亡。

綜上所述，PDT能明顯抑制人SCLC H446細胞增殖，并誘導其發(fā)生凋亡，呈光敏劑濃度與激光功率密度依賴性，其機制可能與上調(diào)Bax和Caspase-9mRNA的表達以及下調(diào)Bcl-2mRNA的表達有關。本研究結果為PDT在肺癌中的臨床應用提供了一定的理論支持。