楊檳伊,陳偉明,孫凌云,尉嘉斌,范煦,鹿洪亭

(1 青島大學醫(yī)學部兒科學系,山東 青島 266021； 2 勝利油田中心醫(yī)院新生兒科； 3 青島大學附屬青島市婦女兒童醫(yī)院小兒外科)

神經(jīng)母細胞瘤(NB)是起源于神經(jīng)嵴細胞的實體瘤，通常發(fā)生于腎上腺髓質(zhì)，也可發(fā)生于頸、胸、腹和骨盆的交感神經(jīng)節(jié)中，是兒童最常見的顱外實體瘤。NB在臨床表現(xiàn)上具有異質(zhì)性，能自發(fā)消退或進展和轉(zhuǎn)移并對各種治療具有耐受性[1]。micro-RNAs(miRNAs)是一類獨特的非編碼小RNA，在腫瘤細胞中高表達或低表達發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用，使細胞增殖和分化失去控制，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。miRNA可通過直接結(jié)合靶mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)發(fā)揮其生物學功能[3]。已有研究顯示，miR-17-5p在結(jié)直腸癌、胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤中表達顯著增高[4-6]，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，但是其對NB細胞增殖及遷移的作用尚未有報道。SHI等[7]研究發(fā)現(xiàn)，張力蛋白同源物磷酸脂酶(PTEN)可作為miR-17-5p的有效靶點，通過調(diào)控其下游信號通路PI3K/AKT而抑制甲狀腺癌細胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡。本研究擬探討miR-17-5p對NB細胞增殖、遷移的影響及其機制，以期為NB的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人NB細胞SH-SY5Y細胞株由青島大學醫(yī)學研究中心兒科研究所提供。DMEM培養(yǎng)液購于美國Hyclone公司，BI胎牛血清購于上海逍鵬生物科技有限公司，miR-17-5p模擬物(mimic)和miR-17-5p抑制物(inhibitor)及二者陰性對照NC mimics和NC inhibitor均購于上海吉瑪制藥公司，轉(zhuǎn)染試劑TransIntroTMEL Transfection Reagent購于北京全式金生物公司，RNA-easyTMIsolation Reagent試劑、逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑購于南京諾唯贊生物科技公司，CCK-8試劑盒均購于美國MCE有限公司，Transwell小室購于美國Corning公司，實驗相關(guān)蛋白PTEN、蛋白激酶B(AKT)、第473位的絲氨酸磷酸化AKT(p-AKT Ser473)抗體均購于美國CST公司，山羊抗兔IgG(二抗)、肌動蛋白(β-Actin)抗體均購于中國武漢賽維爾公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 SH-SY5Y細胞用含體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞密度達到90%時，用胰蛋白酶消化液按1∶2的比例傳代保存細胞。取處于對數(shù)生長期的細胞接種在6孔板中，待細胞匯合度達到75%時，隨機分為NC mimics組(A組)、miR-17-5p mimics組(B組)、NC inhibitor組(C組)和miR-17-5p inhibitor組(D組)，分別轉(zhuǎn)染20 μmol/L的NC mimics、miR-17-5p mimics、NC inhibitor和miR-17-5p inhibitor。參照轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟進行轉(zhuǎn)染，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實驗。

1.2.2實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測miR-17-5p表達 使用總RNA提取試劑(Trizol試劑)提取各組SH-SY5Y細胞的RNA，用紫外線分光光度計檢測其濃度和純度，放于-80 ℃冰箱中備用。使用莖環(huán)法進行RNA逆轉(zhuǎn)錄，參照說明書操作，以U6作為相對定量內(nèi)參照。RT-PCR反應(yīng)體系為：熒光顯色劑(2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix)10.0 μL,前鏈(Forward Primer)0.5 μL,后鏈(Reverse Primer)0.5 μL,模板(cDNA)1.0 μL,加入雙蒸水(ddH2O)補足體積至20.0 μL。PCR引物及其序列見表1。RT-PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃、3 min；循環(huán)反應(yīng)95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，共進行40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，結(jié)果采用2-△△Ct法進行相對定量。實驗重復(fù)3次。

表1 RT-PCR引物及其序列

1.2.3CCK-8實驗檢測細胞增殖能力 取各組處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，用胰蛋白酶消化后收集細胞，調(diào)整密度至每孔2 000個細胞，接種于96孔板，每孔加細胞懸液100 μL。于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)0、1、2、3、4 d后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h后，測定450 nm波長處的吸光度(A)值。每組實驗設(shè)置5個復(fù)孔。

1.2.4菌落形成實驗 取4組細胞分別接種到6孔板中(每孔500個細胞)，加入含體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育14 d。然后用40 g/L多聚甲醛固定10 min，10 g/L結(jié)晶紫染色10 min后,流水沖洗染色液并在空氣中干燥5 min。肉眼直接計數(shù)各組細胞的菌落形成數(shù)量并拍照。

1.2.5Transwell小室檢測細胞遷移能力 取4組SH-SY5Y細胞分別接種于24孔板，調(diào)整細胞的密度為1×108/L。在Transwell小室的下室中加入600 μL含體積分數(shù)0.30胎牛血清的培養(yǎng)液，在上室中加入200 μL僅用DMEM培養(yǎng)液混勻的細胞懸液。隨后將24孔板置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h，將遷移細胞用40 g/L多聚甲醛溶液固定25 min，然后用10 g/L結(jié)晶紫染色20 min。隨機選擇5個視野(200倍)計數(shù)細胞的轉(zhuǎn)移數(shù)量，并拍照。

1.2.6Western blot方法檢測各組p-AKT/AKT、PTEN蛋白的表達 將4組細胞分別接種于6孔板，培養(yǎng)48 h后收集細胞，使用RIPA細胞裂解液提取總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度和純度。每1 μL蛋白樣品加入0.25 μL的蛋白上樣緩沖液(5×buffer)，混合后變性使用。通過SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h后，加入1∶1 000比例稀釋的PTEN、AKT、p-AKT及β-Actin一抗工作液，4 ℃孵育過夜；洗膜后再加入1∶1 000比例稀釋后的二抗工作液，室溫孵育1 h。滴加化學發(fā)光液(ECL液)后在凝膠成像系統(tǒng)中曝光并拍照，采用Image J軟件分析PTEN和p-AKT/AKT蛋白的表達水平。以上所有實驗均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染后各組SH-SY5Y細胞miR-17-5p表達比較

與NC mimics組相比較，miR-17-5p mimics組SH-SY5Y細胞miR-17-5p的表達水平顯著增高(t=8.910，P<0.01)；與NC inhibitor組相比，miR-17-5p inhibitor組SH-SY5Y細胞miR-17-5p的表達水平降低(t=12.990，P<0.001)。見表2。

2.2 各組SH-SY5Y細胞增殖能力比較

細胞增殖實驗的結(jié)果顯示，SH-SY5Y細胞增殖能力存在時間和組別交互作用(F=17.54，P<0.01)。單獨效應(yīng)分析顯示，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，miR-17-5p mimics組SH-SY5Y細胞的增殖能力較NC mimics組明顯增高，而miR-17-5p inhibitor組較NC inhibitor組降低(F=408.47,P<0.01)；不同組別細胞增殖能力比較差異有顯著性，其中miR-17-5p mimics組的細胞增殖能力較NC mimics組強，而miR-17-5p inhibitor組的細胞增殖能力則較NC inhibitor組弱(F=122.30，P<0.01)。見圖1。

2.3 各組細胞菌落數(shù)量和細胞遷移數(shù)量比較

各組SH-SY5Y細胞的菌落數(shù)量、細胞遷移數(shù)量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=23.07、40.02，P<0.01)，其中miR-17-5p mimics組細胞菌落數(shù)量、細胞遷移數(shù)量較NC mimics組顯著增高，miR-17-5p inhibitor組細胞菌落數(shù)量、細胞遷移數(shù)量較NC inhibitor組明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2和圖2、3。

A：NC mimics組，B：miR-17-5p mimics組，C：NC inhibitor組，D：miR-17-5p inhibitor組。

表2 各組SH-SY5Y細胞miR-17-5p表達、細胞菌落和細胞遷移數(shù)量比較

2.4 miR-17-5p靶基因結(jié)合位點及各組SH-SY5Y細胞PTEN mRNA表達比較

通過對TargetScan數(shù)據(jù)庫分析顯示，miR-17-5p在PTEN的3’非翻譯區(qū)域(3’-UTR)具有潛在的結(jié)合部位。見圖4。與NC mimics組比較，miR-17-5p mimics組PTENmRNA的表達水平顯著降低(t=4.75，P<0.01)；與NC inhibitor組相比較，miR-17-5p inhibitor組PTENmRNA的表達水平明顯升高(t=2.94，P<0.05)。見表3。

2.5 各組PTEN、AKT和p-AKT蛋白表達比較

與NC mimics組相比較，miR-17-5p mimics組SH-SY5Y細胞中PTEN蛋白表達明顯降低，而p-AKT/AKT蛋白比值升高(t=5.644、6.892,P<0.01)；與NC inhibitor組比較，miR-17-5p inhibitor組SH-SY5Y細胞PTEN蛋白表達顯著升高，而p-AKT/AKT比值降低(t=3.676、3.231，P<0.05)。見圖5和表3。

A：NC mimics組，B：miR-17-5p mimics組，C：NC inhibitor組，D：miR-17-5p inhibitor組。

A：NC mimics組，B：miR-17-5p mimics組，C：NC inhibitor組，D：miR-17-5p inhibitor組。結(jié)晶紫染色，200倍。

圖中紅色字體為結(jié)合位點

A：NC mimics組，B：miR-17-5p mimics組，C：NC inhibitor組，D：miR-17-5p inhibitor組。

表3 各組SH-SY5Y細胞PTEN mRNA和蛋白表達、p-AKT/AKT比值比較

3 討 論

研究證實，miRNA無論在腫瘤細胞中過表達或抑制表達均會對癌癥的發(fā)展方向起引導(dǎo)作用，使腫瘤細胞的增殖和分化失去控制，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前，miRNAs為診斷癌癥和判定預(yù)后的生物標志物，可通過其獨特的功能來調(diào)控細胞的分化、增殖及遷移等相關(guān)信號通路的表達[2]。miRNA在NB細胞的發(fā)生和發(fā)展中作用受到越來越多的關(guān)注，其可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)某些抑癌基因或癌基因的表達，發(fā)揮重要的抑癌或致癌功能，在NB的發(fā)病過程中占據(jù)重要地位[8]。miR-17-5p為miRNA族群中的一員，現(xiàn)已被發(fā)現(xiàn)可通過復(fù)雜的調(diào)控機制參與腫瘤細胞的增殖及遷移[9]。QU等[10]研究顯示，miR-17-5p可負向調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子受體-2,其表達減少或缺失可導(dǎo)致胃癌細胞增殖和侵襲失控，從而促進細胞增殖和遷移。YANG等[11]研究顯示，miR-17-5p可通過p38-MAPK-HSP27信號途徑促進人肝癌細胞的增殖和遷移。綜上，miR-17-5p表達升高對腫瘤細胞的增殖及遷移具有促進作用。

本研究通過轉(zhuǎn)染miR-17-5p模擬物和抑制物后顯示，miR-17-5p模擬物在NB細胞中高表達，而miR-17-5p抑制物在NB細胞中的表達顯著降低，提示miR-17-5p可能在NB細胞的增殖和遷移中發(fā)揮重要作用。為探討miR-17-5p在NB細胞中的作用機制，本研究進行了CCK-8實驗、菌落形成實驗及細胞遷移實驗。研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-17-5p表達會對NB細胞的增殖和遷移產(chǎn)生促進作用；而下調(diào)miR-17-5p表達會對NB細胞的增殖和遷移產(chǎn)生抑制影響。以上結(jié)果說明miR-17-5p為NB細胞的促進因子，在NB的進展中發(fā)揮重要作用。

目前，NB的治療十分困難，不僅因為腫瘤細胞的惡性程度高，耐藥情況嚴重，還因其容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。信號調(diào)控通路及分子靶向應(yīng)用可能在NB治療中發(fā)揮重要作用[12]。近年來，分子靶向治療成為研究熱點，原因在于其可準確地定位在某個關(guān)鍵部位發(fā)揮治療作用。據(jù)報道，PTEN可參與許多細胞過程，如細胞增殖、代謝、轉(zhuǎn)移、極性、細胞周期等活動過程[13]。本研究通過生物信息學預(yù)測網(wǎng)站測得miR-17-5p的靶基因是PTEN，說明PTEN可能在NB細胞中產(chǎn)生重要影響。為進一步探討兩者關(guān)系，本文研究分別檢測上調(diào)和下調(diào)miR-17-5p對PTENmRNA表達影響，結(jié)果下調(diào)miR-17-5p后PTENmRNA表達升高，而上調(diào)miR-17-5p后則相反，提示miR-17-5p可下調(diào)PTENmRNA的表達，而且PTEN可作為靶基因參與NB細胞的生命活動進展。CHEN等[13]研究發(fā)現(xiàn)，因PTEN缺失介導(dǎo)的PI3K/AKT信號通路的改變對高級別漿液性卵巢癌的治療有關(guān)鍵性作用。WU等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PTEN通過激活PI3K/AKT信號通路，促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，從而使NB治療變得更加困難。提示由PTEN介導(dǎo)的PI3K/AKT信號通路在調(diào)控NB細胞功能及治療上發(fā)揮重要作用。本研究探討了miR-17-5p通過PTEN對PI3K/AKT信號通路的影響，研究結(jié)果顯示，miR-17-5p高表達時PTEN蛋白表達降低，p-AKT/AKT比值升高；而抑制miR-17-5p表達時PTEN蛋白表達顯著升高，p-AKT/AKT比值降低，提示miR-17-5p可能通過下調(diào)PTEN來激活PI3K/AKT信號通路。

綜上所述，miR-17-5p高表達會促進NB細胞增殖和遷移，使PTEN蛋白表達降低、p-AKT蛋白表達升高，而AKT蛋白表達沒有變化，提示miR-17-5p可能是通過PTEN激活PI3K/AKT信號通路而促進NB細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。因此，上調(diào)miR-17-5p表達有可能為治療NB提供新的理論基礎(chǔ)和診療手段。但本研究僅局限在細胞水平上，需在腫瘤組織及動物水平上進一步驗證miR-17-5p對NB進展的影響，以挽救更多病兒的生命。