賈紅霞,安立才,王蕾,劉英慧,初曉霞

(青島大學附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院血液科,山東 煙臺 264000)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種單克隆性漿細胞惡性增殖的血液系統(tǒng)腫瘤，約占所有血液系統(tǒng)腫瘤的10%，發(fā)病率及死亡率高[1-2]。近年來隨著各種治療手段的應用，MM病人的生存期明顯延長[3-4]。但耐藥和克隆進化是必然會發(fā)生的，從而導致疾病進展[5]。C-MYC基因具有促進細胞增殖、誘導細胞周期、抑制分化以及誘導凋亡等作用。有研究結(jié)果表明，C-MYC的激活在MM的發(fā)病機制中起著重要作用[6-7]。C-MYC表達增加參與了單克隆丙種球蛋白病(MGUS)或亞臨床型多發(fā)性骨髓瘤(SMM)向MM的轉(zhuǎn)變，是影響晚期疾病進展的關(guān)鍵因素；C-MYC的過表達也與更具侵襲性的MM有關(guān)，如漿細胞白血病和髓外疾病[8-11]。C-MYC基因重排在初診MM病人中約占15%，在進展期MM病人中約占50%，而在MGUS中幾乎未見；此外，C-MYC表達隨著MM發(fā)病階段的進展而增加[6,12-14]。因此，C-MYC基因的檢測對于MM預后的評估具有明顯價值。目前研究已經(jīng)證實，MM病人存在明顯的免疫功能異常，除了有體液免疫功能缺陷外，細胞免疫功能也有異常，主要表現(xiàn)為T淋巴細胞亞群表型、功能、數(shù)量的異常[15]。有研究表明，C-MYC基因通過多種機制誘導免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，包括誘導腫瘤相關(guān)巨噬細胞的激活和募集，促進免疫抑制分子CD47和PD-L1的表達，降低T、B和NK細胞數(shù)量[16-19]。但MM病人骨髓中C-MYC的過表達是否與淋巴細胞數(shù)量下降存在關(guān)系尚未見報道，C-MYC表達與相關(guān)臨床指標的關(guān)系研究也較少。本研究旨在探討MM病人C-MYC表達與淋巴細胞亞群的關(guān)系，以及二者對預后的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取煙臺毓璜頂醫(yī)院2015年5月—2020年5月新診斷的MM病人106例。排除標準：行造血干細胞移植的MM病人，有其他惡性腫瘤、自身免疫性疾病、非骨髓瘤腎病、嚴重肝膽疾病等可影響實驗結(jié)果疾病的病人，信息不完整的病人。收集病人治療前白細胞介素-6(IL-6)、乳酸脫氫酶(LDH)、β2微球蛋白(β2-MG)、血紅蛋白、血鈣等指標以及2周期化療前后療效評價相關(guān)指標。MM病人的臨床分期采用R-ISS分期，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期。血清清蛋白低于40 g/L時需要對血鈣濃度進行校正：校正血鈣(mmol/L)=血清總鈣(mmol/L)-0.025×血清清蛋白(g/L)+1.0(mmol/L)。同時收集44例健康體檢者外周血檢測淋巴細胞亞群。

1.2 C-MYC表達及淋巴細胞亞群檢測

MM病人骨髓標本中C-MYC表達的檢測采用免疫組織化學方法，所用儀器為瑞士羅氏公司的Benchmark XT，一抗選用Abcam公司的Anti-C-MYC antibody [Y69](ab32072)，二抗選用Abcam公司的Goat Anti-Rabbit IgG H&L(ab205718)。骨髓標本行切片、烤片、標簽打印、Benchmark XT染色、脫水透明、封片等處理，所有染色切片均由兩位病理醫(yī)師雙盲閱片。C-MYC表達陽性率以陽性細胞占腫瘤細胞的百分比表示，以C-MYC表達陽性率≥40%為過表達，<40%為低表達。

應用FACS Calibur流式細胞儀對MM病人及健康體檢者外周血進行淋巴細胞亞群檢測，熒光素標記抗體、溶血素、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自BD公司。用肝素抗凝管采集空腹靜脈血，加入熒光素標記抗體，避光孵育后加入溶血素，再次避光孵育，離心去除上清液后加入PBS，上機檢測外周血淋巴細胞比例。CD4+T細胞比例正常值范圍30.09%～40.41%，CD8+T細胞比例正常值范圍為20.74%～29.42%，CD4/CD8比值正常值范圍0.98～2.07。

1.3 治療與療效評價

所有病人均應用三聯(lián)含有硼替佐米的一線治療方案治療，包括BCD(硼替佐米+環(huán)磷酰胺+地塞米松)、BRD(硼替佐米+來那度胺+地塞米松)、BTD(硼替佐米+沙利度胺+地塞米松)、BAD(硼替佐米+阿霉素+地塞米松)。2周期化療后，根據(jù)國際骨髓瘤工作組(IMWG)療效標準進行療效評估[20]，分為嚴格意義的完全緩解(sCR)、完全緩解(CR)、非常好的部分緩解(VGPR)、部分緩解(PR)、微小緩解(MR)、疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進展(PD)。無進展生存期(PFS)是指從治療開始至病人首次疾病進展、死亡或末次隨訪的時間?？偵嫫?OS)是指從確診開始至病人死亡或末次隨訪的時間。生存隨訪時間截至2021年1月，中位隨訪時間18(3～39)個月。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 MM病人骨髓組織C-MYC表達與一般臨床指標的關(guān)系

C-MYC低表達病人68例，男31例，女37例；C-MYC過表達病人38例，男26例，女12例。C-MYC過表達組MM病人的LDH、IL-6、β2-MG、血鈣水平明顯高于C-MYC低表達組，血紅蛋白水平明顯低于C-MYC低表達組，差異均有顯著性(t=-5.992～4.690，P<0.05)。MM病人骨髓組織C-MYC表達與IL-6(r=0.235，P<0.05)、LDH(r=0.627，P<0.001)、血鈣(r=0.223，P<0.05)呈正相關(guān)，與血紅蛋白呈負相關(guān)(r=-0.262，P<0.01)；C-MYC表達與β2-MG未見明顯相關(guān)性(r=0.121，P>0.05)。見表1。

2.2 MM病人骨髓組織C-MYC表達與淋巴細胞亞群的關(guān)系

與健康者相比，MM病人的CD4+T細胞比例、CD4/CD8比值明顯下降，CD8+T細胞比例明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(t=-8.711～5.675，P<0.01)。C-MYC過表達組MM病人的CD8+T細胞比例明顯高于C-MYC低表達組(t=-3.545，P<0.01)，CD4+T細胞比例、CD4/CD8比值明顯低于C-MYC低表達組(t=2.384、3.119，P<0.05)。MM病人骨髓組織C-MYC表達與CD8+T細胞比例呈正相關(guān)(r=0.319，P<0.01)，與CD4+T細胞比例、CD4/CD8比值呈負相關(guān)(r=-0.217、-0.297，P<0.05)。見表1、2。

表1 C-MYC低表達和過表達組MM病人相關(guān)臨床指標的比較

表2 健康者與MM病人淋巴細胞亞群的比較

2.3 MM病人R-ISS分期與C-MYC表達和淋巴細胞亞群的關(guān)系

本研究106例MM病人中，R-ISS分期為Ⅰ期18例，Ⅱ期58例，Ⅲ期30例。R-ISS分期Ⅲ期MM病人的C-MYC表達明顯高于Ⅰ、Ⅱ期病人(H=32.795，Z=-4.669、-5.223，P<0.001)；R-ISS分期Ⅲ期MM病人的CD4+T細胞比例明顯低于Ⅰ期病人(F=3.570，P<0.05)，CD4/CD8比值明顯低于Ⅰ、Ⅱ期病人(F=7.787，P<0.01)，CD8+T細胞比例明顯高于Ⅰ、Ⅱ期病人(F=9.147，P<0.001)。見表3。

2.4 C-MYC表達和淋巴細胞亞群對MM病人療效及預后的影響

C-MYC低表達組與過表達組、CD4+T細胞比例<30.09%組與≥30.09%組、CD8+T細胞比例<29.42%組與≥29.42%組、CD4/CD8比值<0.98組與≥0.98組的化療方案比較差異均無顯著性。

表3 MM病人R-ISS分期與C-MYC表達和淋巴細胞亞群的關(guān)系

接受2周期化療后，C-MYC低表達組MM病人的療效較C-MYC過表達組更好(Z=-8.625，P<0.01)。C-MYC低表達組MM病人的PFS和OS較C-MYC過表達組有明顯延長(χ2=36.922、44.893，P<0.001)。CD4+T細胞比例<30.09%組病人的PFS和OS較CD4+T細胞比例≥30.09%組病人明顯縮短(χ2=10.446、17.626，P<0.01)。CD8+T細胞比例的改變對MM病人PFS和OS無明顯影響(χ2=2.057、3.790，P>0.05)。CD4/CD8比值<0.98組病人PFS和OS較CD4/CD8比值≥0.98組明顯縮短(χ2=30.121、12.610，P<0.001)。單因素COX回歸分析結(jié)果顯示，C-MYC表達、年齡、IL-6、LDH、β2-MG、血鈣、血紅蛋白、CD4+T細胞比例、CD4/CD8比值是影響MM病人預后的因素。將這些因素進一步行多因素COX回歸分析結(jié)果顯示，C-MYC過表達、CD4/CD8比值<0.98是MM病人OS的獨立危險因素，C-MYC過表達的風險比(HR)為0.152，CD4/CD8比值下降的HR為6.699。見表4、5和圖1。

表4 C-MYC低表達與過表達組MM病人療效比較(例)

表5 MM病人預后影響因素的多因素COX回歸分析

3 討 論

MM目前仍無法治愈。漿細胞的異常增殖和單克隆免疫球蛋白的大量分泌使MM病人免疫功能受損。C-MYC在人類中能調(diào)節(jié)約15%的靶基因，從而調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖、分化、凋亡等。有研究結(jié)果顯示，初診MM病人骨髓組織中C-MYC蛋白表達陽性率為72.31%，約40%的初診MM病人C-MYC過表達[21-22]，這說明C-MYC參與了MM的早期發(fā)病。

本研究分析了C-MYC表達與部分臨床指標的關(guān)系，以明確C-MYC表達是否與MM的臨床惡性表現(xiàn)存在相關(guān)性。β2-MG可以有效反映骨髓瘤細胞增殖的活性，直接反映病人體內(nèi)的腫瘤負荷，是R-ISS分期參考標準之一。本文研究結(jié)果顯示，C-MYC過表達組MM病人的β2-MG水平明顯高于C-MYC低表達組，提示C-MYC過表達的MM病人腫瘤負荷較重。IL-6在體內(nèi)外均能促進MM細胞的增殖，其水平會隨著MM分期的升高而明顯上升[23]。還有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6能夠刺激MM細胞中C-MYC的表達[24]。本研究結(jié)果顯示，C-MYC表達與IL-6表達水平呈正相關(guān)，C-MYC過表達組MM病人的IL-6水平明顯升高。這與有關(guān)研究結(jié)果相符[24]。LDH是無氧糖酵解及糖異生過程中重要的輔酶之一，其水平升高提示無氧糖酵解途徑活躍，而腫瘤細胞主要通過無氧糖酵解途徑提供能量。有研究表明，LDH與MM病人的不良預后有關(guān)[25]。本研究結(jié)果顯示，C-MYC低表達與過表達組的LDH水平有明顯差異，C-MYC的表達與LDH水平呈正相關(guān)。因為廣泛的骨質(zhì)破壞，高鈣血癥是MM病人主要的并發(fā)癥之一。許多研究結(jié)果表明，高鈣血癥是MM病人的獨立預后因素[26-27]。本研究結(jié)果顯示，C-MYC過表達組MM病人的血鈣水平明顯高于C-MYC低表達組，MM病人C-MYC表達與血鈣呈正相關(guān)，表明C-MYC表達可以作為MM病人的預后危險因素。貧血是MM常見的癥狀之一。有研究發(fā)現(xiàn)，MM病人的貧血程度與腫瘤負荷相關(guān)，隨著血紅蛋白的降低，MM的相對危險度逐漸升高[28-29]。本研究中血紅蛋白和C-MYC表達呈負相關(guān)，C-MYC過表達組MM病人血紅蛋白水平更低，貧血重提示病人的骨髓浸潤較重，預后不良?？傊琈M病人C-MYC過表達表明腫瘤負荷較重，預示著更重的臨床惡性表現(xiàn)。

為進一步明確C-MYC表達對MM病人預后的影響，本研究比較了不同臨床分期病人C-MYC的表達情況，以及C-MYC過表達與低表達病人治療效果的差異。結(jié)果顯示，R-ISS分期Ⅲ期MM病人的C-MYC表達明顯高于Ⅰ、Ⅱ期病人；C-MYC過表達MM病人2周期的化療效果較C-MYC低表達病人差。這與之前的有關(guān)研究結(jié)果相一致[22]，提示C-MYC過表達與R-ISS分期呈正相關(guān)，影響病人的預后。

MM病人的體液免疫及細胞免疫均受損。MM病人體內(nèi)抗腫瘤免疫應答主要由T細胞介導。本文研究結(jié)果顯示，MM病人的CD4+T細胞比例、CD4/CD8比值明顯低于健康者，CD8+T細胞的比例明顯高于健康者，表明MM病人體內(nèi)免疫功能受損。為探討MM病人免疫異常與腫瘤負荷的關(guān)系，本研究對不同臨床分期MM病人的T淋巴細胞亞群進行了分析，結(jié)果顯示，R-ISS分期Ⅲ期病人的T淋巴細胞亞群分布與Ⅰ、Ⅱ期病人有明顯的差異。這表明MM病人的免疫功能異常與機體腫瘤負荷存在相關(guān)性，進一步證實了免疫微環(huán)境異常為MM發(fā)生、發(fā)展不可或缺的一環(huán)。

A、B分別為C-MYC表達對MM病人PFS和OS的影響；C、D分別為CD4+T細胞比例對MM病人PFS和OS的影響；E、F分別為CD8+T細胞比例對MM病人PFS和OS的影響；G、H分別為CD4/CD8比值對MM病人PFS和OS的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，C-MYC基因能夠誘導免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的形成，可以抑制免疫反應、驅(qū)動免疫逃避，從而促進腫瘤的生長[17-18]。在非小細胞性肺癌、急性T淋巴細胞白血病中，C-MYC可以與PD-L1啟動子結(jié)合促進PD-L1表達，從而影響機體的細胞免疫功能[17]。但是，目前尚不清楚MM病人中C-MYC與免疫功能的關(guān)系。本研究分析了MM病人T淋巴細胞亞群與骨髓組織C-MYC表達關(guān)系，結(jié)果顯示，C-MYC過表達組MM病人的CD4+T細胞比例、CD4/CD8比值較C-MYC低表達組明顯降低，CD8+T細胞比例較C-MYC低表達組明顯升高；相關(guān)性分析顯示，C-MYC的表達與CD4+T細胞比例、CD4/CD8比值呈負相關(guān)，與CD8+T細胞比例呈正相關(guān)。這說明C-MYC過表達的MM病人體內(nèi)免疫水平更差。C-MYC表達可能會影響淋巴細胞亞群的數(shù)量進而影響病人的免疫功能，其具體機制尚有待進一步研究。

本研究生存分析結(jié)果顯示，C-MYC過表達、CD4+T細胞比例降低、CD4/CD8比值降低的MM病人PFS和OS更短，提示這些病人有較差的預后。進一步行多因素COX回歸分析顯示，C-MYC過表達、CD4/CD8比值降低是MM病人預后的獨立危險因素，表明C-MYC的表達強度和淋巴細胞亞群變化會影響MM病人的預后[22,30-32]。

綜上所述，C-MYC表達和淋巴細胞亞群變化與MM病人的預后相關(guān)，C-MYC表達越高病人的生存期越短，檢測C-MYC表達變化可以作為MM預后判斷的依據(jù)，同時靶向C-MYC的藥物可能是MM病人一種潛在治療方式。此外，C-MYC的表達水平與淋巴細胞亞群變化具有相關(guān)性，提示MM病人C-MYC的表達可能對淋巴細胞數(shù)量產(chǎn)生影響，進而影響MM病人的免疫功能，但其具體機制有待進一步研究。