劉曉莉,張妮,趙龍,董琳

(1 青島市市立醫(yī)院檢驗(yàn)科,山東 青島 266011； 2 青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)檢驗(yàn)科； 3 山東省千佛山醫(yī)院血液內(nèi)科)

非霍奇金淋巴瘤(NHL)是最常見的血液惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率迅速上升[1]。85%的NHL為B細(xì)胞來源。根據(jù)其臨床特征，B細(xì)胞NHL(B-NHL)一般分為侵襲性和惰性兩大類[1]。其中惰性B-NHL約占1/3，被認(rèn)為是復(fù)發(fā)難治性淋巴瘤[2-3]。

B-NHL缺乏特異的臨床癥狀，使得其早期診斷的可行性較差。近年來，計(jì)算機(jī)斷層掃描和磁共振成像方法等常用于提示診斷[4-5]。B-NHL的臨床病理診斷，會(huì)給病人帶來一定的穿刺痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[6]。因此，需要開發(fā)一種新的無創(chuàng)性診斷方法，區(qū)分B-NHL的病理分型，監(jiān)測(cè)其發(fā)生發(fā)展。與病理診斷和成像方法相比，檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物更便捷、更經(jīng)濟(jì)[7]。代謝組學(xué)分析是對(duì)生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析，尋找代謝物與生理病理變化相對(duì)關(guān)系的研究方式，是系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分。疾病導(dǎo)致機(jī)體病理生理過程變化，最終引起代謝產(chǎn)物發(fā)生相應(yīng)的改變，通過對(duì)某些代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，并與正常人的代謝產(chǎn)物比較，尋找疾病的生物標(biāo)記物，可為疾病診斷提供參考。因其無創(chuàng)性和足夠的體積，尿液被認(rèn)為是理想的代謝組學(xué)分析物質(zhì)[8]。由于癌癥引起嚴(yán)重的代謝紊亂，尿液揮發(fā)性有機(jī)物的綜合分析可能有助于尋找癌癥的代謝生物標(biāo)志物[9]。本研究使用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜方法對(duì)B-NHL病人尿液中揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行了初步分析[10-11]，以評(píng)估尿液中揮發(fā)性有機(jī)物作為B-NHL鑒別診斷標(biāo)志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要材料

尿液中定量化合物所用HPLC級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。氦(純度為99.999%)由中國山東濟(jì)寧協(xié)力特種氣體有限公司生產(chǎn)。便攜式pH值測(cè)試筆(R&D，MN，USA)，聚四氟乙烯(PTFE)隔膜覆蓋20 mL氣相色譜GC瓶(Shimadzu，Kyoto，Japan)。SPME手工固定器和75 μm羧基聚二甲基硅氧烷纖維(Sigma-Aldrich)。GC-MS QP 2010氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀由島津公司生產(chǎn)。

1.2 研究對(duì)象

從2015—2017年在青島市市立醫(yī)院就診的淋巴瘤病人中，選取50例未經(jīng)治療的臨床病理診斷為B-NHL的病人作為實(shí)驗(yàn)組，選取20例臨床病理診斷為淋巴結(jié)反應(yīng)性增生的病人及10例健康的家屬作為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：有癌癥病史；妊娠或哺乳期女性；有代謝性疾病，如糖尿病等；有肝臟或泌尿系統(tǒng)疾病；吸煙或飲酒者；使用特定藥物，如抗生素、糖皮質(zhì)激素、非甾體類藥物等。50例B-NHL病人中，男性27例，女性23例；平均年齡(55.4±15.6)歲；侵襲性B-NHL者17例，惰性B-NHL者33例。在17例侵襲性B-NHL病人中，根據(jù)安娜堡分期系統(tǒng)分期，早期(Ⅰ～Ⅱ期)者7例，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)者10例；CD20陽性表達(dá)者11例，陰性表達(dá)者6例；國際預(yù)后指數(shù)(IPI)低分(0～2分)者8例，高分(3～5分)者9例。在33例惰性B-NHL病人中，早期者11例，晚期者22例；CD20陽性表達(dá)者10例，陰性表達(dá)者23例；IPI低分者15例，高分者18例。對(duì)照組30例，男性21例，女性9例；平均年齡(45.7±14.3)歲。所有受試者參加本研究均簽署知情同意書。本研究得到了青島市市立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，人體尿液的使用符合《赫爾辛基宣言》指南。

1.3 樣品制備及揮發(fā)性有機(jī)物的篩選

所有受試者夜間禁食禁水，在禁食禁水期間，用一個(gè)30 mL量程無菌玻璃瓶(山東浩鑫玻璃制品有限公司)收集所排尿液，隨后密封玻璃瓶，4 ℃下保存，并且在收集1 h內(nèi)送至青島市市立醫(yī)院檢驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)室完成氣相色譜-質(zhì)譜等分析。將尿液樣品分為10 mL等分試樣，放在20 mL液相色譜瓶中，根據(jù)最終所需pH值，分別加入0.1 mL的5 mol/L HCl、5 mol/L NaOH和超純水。將標(biāo)準(zhǔn)分析物(在甲醇中制備)加入到一個(gè)20 mL液相色譜瓶中，依次添加3 g氯化鈉、0.1 mL的5 mol/L HCl、0.1 mL 的5 mol/L NaOH和超純水，制備校準(zhǔn)樣品。將尿液加入到一個(gè)20 mL液相色譜瓶中，依次添加3 g氯化鈉、0.1 mL的5 mol/L HCl、0.1 mL 的5 mol/L NaOH和超純水，制備對(duì)照樣品。將10 mL超純水加入到一個(gè)20 mL液相色譜瓶中，依次添加3 g氯化鈉、0.1 mL的5 mol/L HCl、0.1 mL 的5 mol/L NaOH和超純水，制備空白樣品。采用校準(zhǔn)樣品和對(duì)照樣品評(píng)價(jià)分析線性度，采用空白樣品評(píng)價(jià)分析方法的精密度、檢測(cè)和定量限值。在酸化、堿化、未改性的pH值條件下，通過與2015版美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)局(NIST)化學(xué)數(shù)據(jù)庫中收錄的揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行比對(duì)，分析尿液中的碎片信號(hào)和強(qiáng)度，并通過使用基于標(biāo)準(zhǔn)化合物的內(nèi)部保留時(shí)間庫來分析差異性標(biāo)志物的保留時(shí)間，鑒定不同類型B-NHL病人的尿液譜。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜分析

將待檢樣品置入頂空瓶中，加蓋密封，隨即將萃取頭穿透瓶蓋插入頂空瓶，推出萃取頭纖維，使其置于液平面上空，將頂空瓶連同萃取頭放于40 ℃恒溫箱中靜置30 min，使萃取頭充分萃取尿液揮發(fā)性有機(jī)物。萃取后，退回纖維頭，小心拔出萃取頭，將其手動(dòng)插入氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)樣口，推出纖維頭。氣相色譜注入口溫度為250 ℃，氣相載氣為氦氣，流量為1 mL/min，采用無分流模式。柱烘箱溫度35 ℃，保持2 min；以6 ℃/min速度升溫到150 ℃；以12 ℃/min速度升溫到250 ℃，保持3 min。質(zhì)譜儀的離子源溫度為200 ℃，檢測(cè)器工作在45～350質(zhì)荷比(m/z)的范圍內(nèi)。高溫解析5 min后再讀數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 揮發(fā)性有機(jī)物的篩選和鑒定

鑒定出的揮發(fā)性有機(jī)物包括醛、酮、酸、醇、苯衍生物、酚、酯、呋喃和含硫化合物等各種化學(xué)族。本研究還進(jìn)一步評(píng)估了具有最高豐度、最高文庫比對(duì)百分比以及B-NHL病人和健康對(duì)照者尿液中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的揮發(fā)性有機(jī)物碎片離子m/z。在所有pH值條件下一共鑒定出170種揮發(fā)性有機(jī)物，其中28種揮發(fā)性有機(jī)物在全部B-NHL病人的尿樣中出現(xiàn)。酸化樣品檢測(cè)到115種揮發(fā)性有機(jī)物，其中20種在所有樣本中存在。堿化樣品檢測(cè)到126種揮發(fā)性有機(jī)物，其中23種普遍存在。未修飾pH值條件下尿樣中檢出77種揮發(fā)性有機(jī)物，其中21種普遍存在。最終篩選出了9種在堿化、酸化、未修飾pH值條件下尿樣中共有的揮發(fā)性有機(jī)物，分別為丙酮、2-丁酮、4-庚酮、二甲基二硫醚、呋喃、2-甲基丁醛、2-甲基吡嗪、癸酸和2,6-二甲基-7-辛烯-2-醇等。見表1。

2.2 揮發(fā)性標(biāo)志物的定量分析

與健康對(duì)照者相比，B-NHL、淋巴結(jié)反應(yīng)性增生病人尿液標(biāo)本中4-庚酮、2-甲基吡嗪、2-甲基丁醛、癸酸和2,6-二甲基-7-辛烯-2-醇水平差異有顯著性(t=2.493～13.643，P<0.05)。侵襲性B-NHL和惰性B-NHL病人之間4-庚酮、癸酸的濃度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=2.109、2.101，P<0.05)。淋巴結(jié)反應(yīng)性增生病人和B-NHL病人之間4-庚酮、2-甲基吡嗪濃度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=6.737、2.693，P<0.05)。見表2。

表1 B-NHL病人尿液中揮發(fā)性有機(jī)物的篩選及鑒定

2.3 揮發(fā)性標(biāo)志物的診斷價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，能鑒別B-NHL與非淋巴瘤的揮發(fā)性標(biāo)志物為4-庚酮、2-甲基吡嗪、2-甲基丁醛(AUC=0.634～0.961，P<0.05)；4-庚酮、2-甲基丁醛、癸酸是區(qū)分侵襲性和惰性B-NHL的理想揮發(fā)性標(biāo)志物(AUC=0.657～0.795，P<0.05)；4-庚酮和2,6-二甲基-7-辛烯-2-醇可以用于區(qū)分早期淋巴瘤和晚期淋巴瘤(AUC=0.772、0.754，P<0.05)；2-甲基丁醛和癸酸可以用于區(qū)分CD20+和CD20-淋巴瘤病人(AUC=0.852、0.851，P<0.05)。聯(lián)合上述揮發(fā)性標(biāo)志物建立的診斷模型比單一標(biāo)志物具有更高的診斷價(jià)值。見表3。

3 討 論

B-NHL在發(fā)病的早期階段無顯著臨床特征，大多數(shù)B-NHL病人預(yù)后差[12]。早期診斷的侵襲性B-NHL病人其預(yù)后顯著優(yōu)于晚期診斷的病人，因此，B-NHL的早期診斷意義重大。以揮發(fā)性化合物作為造血淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤的早期診斷標(biāo)志物具有檢測(cè)量少、無創(chuàng)性和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)小的優(yōu)勢(shì)[13-14]。本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)并聯(lián)合頂空固相微萃取方法對(duì)尿液中揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，B-NHL病人與淋巴結(jié)反應(yīng)性增生病人、健康對(duì)照者比較，尿液中含量有顯著差異的揮發(fā)性有機(jī)物為4-庚酮和2-甲基吡嗪，其中4-庚酮在早期和晚期淋巴瘤病人尿液中含量差異亦有顯著性，提示4-庚酮具有作為B-NHL早期診斷尿揮發(fā)性標(biāo)志物的可行性[8,14]。這與國內(nèi)HUA等[8]的研究報(bào)道一致。

此外，本研究結(jié)果顯示，尿液中揮發(fā)性有機(jī)物4-庚酮、2-甲基丁醛、癸酸和2,6-二甲基-7-辛烯-2-醇能夠明顯識(shí)別B-NHL的關(guān)鍵特征，如CD20+和CD20-、早期和晚期。這些指標(biāo)的診斷靈敏度在70.4%～78.0%之間，特異度在79.4%～91.0%之間，這與國內(nèi)HUA等[8]的研究結(jié)果相似。目前而言，B-NHL的臨床分期主要依據(jù)CT、MRI、PET-CT或者侵襲性骨髓病理學(xué)穿刺等較為昂貴的檢查方法[16]。尿液中揮發(fā)性有機(jī)物的檢測(cè)是一種廉價(jià)、無創(chuàng)的檢測(cè)方法，對(duì)B-NHL的臨床分期有較好的診斷價(jià)值[8,13]。目前B-NHL病人CD20表達(dá)的分類主要依賴免疫組織化學(xué)病理評(píng)分，存在較大的主觀性[17]。由于基層醫(yī)院嚴(yán)重缺乏優(yōu)秀的病理醫(yī)師，因此對(duì)于B-NHL診斷經(jīng)常遇到因CD20導(dǎo)致的誤診甚至漏診[18]。而尿液中揮發(fā)性有機(jī)物作為一種客觀的補(bǔ)充診斷方法，有望提高對(duì)CD20的診斷準(zhǔn)確率。本文ROC曲線分析結(jié)果顯示，能鑒別B-NHL與非淋巴瘤的揮發(fā)性標(biāo)志物為4-庚酮、2-甲基吡嗪、2-甲基丁醛，其中最佳揮發(fā)性標(biāo)志物為4-庚酮，區(qū)分侵襲性和惰性B-NHL的理想揮發(fā)性標(biāo)志物是4-庚酮和癸酸；聯(lián)合揮發(fā)性標(biāo)志物建立的診斷模型比單一標(biāo)志物具有更高的診斷價(jià)值，既可用于區(qū)分淋巴結(jié)反應(yīng)性增生與B-NHL，也可用于區(qū)分侵襲性與惰性B-NHL。這提示尿液中的揮發(fā)性標(biāo)志物或許亦可預(yù)測(cè)B-NHL的臨床預(yù)后，但需要后期進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

表2 兩組尿液標(biāo)本中揮發(fā)性有機(jī)物濃度比較

表3 ROC曲線分析揮發(fā)性標(biāo)志物的診斷價(jià)值

揮發(fā)性化合物可能經(jīng)多種內(nèi)源性生化途徑和外源性途徑(環(huán)境污染、食物、煙草和乙醇等)產(chǎn)生。在內(nèi)源性來源方面，已知在病理過程中可以產(chǎn)生新的揮發(fā)性有機(jī)物或揮發(fā)性有機(jī)物水平可以發(fā)生改變。例如，增加的活性氧可以攻擊細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸，從而產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)物。揮發(fā)性化合物可作為惡性腫瘤的早期診斷標(biāo)志物，其前提是腫瘤在早期階段有顯著的代謝紊亂。為減少外源性來源的混雜因素影響，本研究排除了吸煙者和飲酒者，且各組受試者的飲食習(xí)慣沒有顯著差異。因此，本研究結(jié)果能夠較為真實(shí)地反映出B-NHL病人與淋巴結(jié)反應(yīng)性增生病人和健康對(duì)照者尿液揮發(fā)性有機(jī)物的含量差異。

總之，本研究證實(shí)，尿液中揮發(fā)性有機(jī)物4-庚酮、2-甲基吡嗪、2-甲基丁醛有望用于鑒別診斷B-NHL，4-庚酮、癸酸有望用于區(qū)分惰性與侵襲性B-NHL，4-庚酮和2,6-二甲基-7-辛烯-2-醇有望用于區(qū)分早期和晚期淋巴瘤病人，2-甲基丁醛和癸酸有望用于鑒別CD20+和CD20-淋巴瘤病人，單獨(dú)或聯(lián)合檢測(cè)上述指標(biāo)可能為B-NHL臨床診斷提供參考。