王冰菁,張惠琴,謝俊霞,王俊,

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，山東 青島 266071； 2 中國(guó)石油大學(xué)(華東)校醫(yī)院； 3 青島大學(xué)腦科學(xué)與疾病研究院)

帕金森病(PD)被認(rèn)為是世界上第二常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的缺失[1]。近年來，隨著磁共振成像技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的證據(jù)表明，PD病人黑質(zhì)中的鐵沉積增加[2-3]。鐵是一種過渡金屬，在生物圈中廣泛分布參與電子轉(zhuǎn)移的化學(xué)反應(yīng)，對(duì)正常細(xì)胞功能至關(guān)重要。在鐵、亞鐵和三價(jià)鐵之間的氧化還原循環(huán)存在于生命所必需的各種反應(yīng)中[4]。過量的鐵會(huì)產(chǎn)生有害的活性氧。在大腦中，鐵對(duì)于維持神經(jīng)組織的高代謝和能量需求至關(guān)重要，并且還參與髓鞘合成、神經(jīng)遞質(zhì)合成和代謝[5-6]。生成髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞維持著大腦中最高的鐵濃度[7-8]。少突膠質(zhì)細(xì)胞中含有大量的鐵結(jié)合蛋白，如鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白[9]。已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，高鐵引起二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1表達(dá)下調(diào)，鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(FPN1)表達(dá)上調(diào)[10]。然而高鐵環(huán)境對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鐵代謝相關(guān)蛋白的影響目前仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在探討枸櫞酸鐵銨(FAC)對(duì)MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞購(gòu)于上海拜力生物科技有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)于以色列BI公司，胰酶購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，F(xiàn)AC購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TfR1)抗體和FPN1抗體均購(gòu)于Abcam公司，HRP-IgG標(biāo)記的二抗購(gòu)于Absin公司，BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于TherGmo公司，PVDF膜、ECL發(fā)光液均購(gòu)于美國(guó)Millipore公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理

將未分化的MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞以6×104/cm2密度接種于6孔板，每孔加入2 mL細(xì)胞混懸液培養(yǎng)。為了觀察鐵過載對(duì)TfR1和FPN1表達(dá)的影響，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和FAC組。FAC組用加入100 μmol/L FAC的細(xì)胞培養(yǎng)液處理24 h，對(duì)照組用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液處理。

1.3 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TfR1和FPN1蛋白表達(dá)

藥物處理結(jié)束以后，收集6孔板內(nèi)細(xì)胞蛋白，應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，按照每孔總蛋白20 μg計(jì)算每個(gè)樣本的上樣量。蛋白經(jīng)電泳(80 V、30 min和120 V、90 min)、轉(zhuǎn)膜(300 mA、90 min)后，用100 g/L的脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，再分別加入FPN1(1∶1 000)、TfR1(1∶1 000)和β-actin(1∶10 000)抗體，4 ℃搖床上孵育過夜，然后用TBST溶液洗膜3次(每次10 min)，加入山羊抗兔(1∶10 000)的HRP-IgG二抗室溫孵育1 h，再用TBST溶液洗膜3次(每次10 min)，以ECL發(fā)光液顯影后用Image J軟件分析條帶灰度值。結(jié)果以TfR1和FPN1與β-actin的灰度值比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)AC組細(xì)胞TfR1表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.695，P<0.05)，而兩組細(xì)胞FPN1表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.210，P>0.05)。見表1。

表1 FAC對(duì)MO3.13細(xì)胞鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)影響

3 討 論

許多神經(jīng)退行性疾病的特點(diǎn)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)特定區(qū)域的局部鐵積累[11]。鐵的積累最終可能超過鐵的儲(chǔ)存能力，從而氧化還原活性鐵促進(jìn)氧化應(yīng)激[12]。細(xì)胞內(nèi)鐵主要用于線粒體合成血紅素和鐵硫簇。鐵也參與DNA合成，核糖核苷酸還原酶是鐵依賴性酶，可在真核生物中催化脫氧核糖核苷酸的合成[13]。

少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細(xì)胞，除了維持髓鞘的功能外，該細(xì)胞還維持軸突的完整性，支持軸突代謝，幫助神經(jīng)元存活[14-15]。神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞在許多方面都需要鐵，包括電子傳遞、還原型輔酶Ⅱ活性的維持、軸突髓鞘形成以及作為參與神經(jīng)遞質(zhì)合成的幾種酶的輔助因子[16]。細(xì)胞內(nèi)鐵含量主要取決于鐵吸收和釋放蛋白的表達(dá)，TfR1被認(rèn)為是少突膠質(zhì)細(xì)胞生存、生長(zhǎng)和成熟的必要條件[17]。TfR1通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)鐵的攝取，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)[18]。少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞通過FPN1途徑介導(dǎo)鐵外排[19]。參與腦細(xì)胞鐵輸出的蛋白質(zhì)缺失或表達(dá)減少可能導(dǎo)致大腦中鐵的過度積累和神經(jīng)退行性變，而FPN是哺乳動(dòng)物中唯一已知的輸出細(xì)胞內(nèi)鐵的蛋白質(zhì)[20-21]。哺乳動(dòng)物的鐵代謝受鐵調(diào)節(jié)蛋白(IRPs)的調(diào)節(jié)，IRPs表達(dá)降低，則TfR1表達(dá)降低，F(xiàn)PN1表達(dá)增加，反之亦然[22]。同時(shí)細(xì)胞FPN1的表達(dá)還受到鐵調(diào)素(hepcidin)的影響，hepcidin介導(dǎo)FPN1的細(xì)胞內(nèi)吞，hepcidin表達(dá)增加，則FPN1表達(dá)降低[23]。Hepcidin的表達(dá)主要由鐵或炎癥刺激誘導(dǎo)，鐵的攝入刺激hepcidin表達(dá)防止高鐵血癥和進(jìn)一步的膳食鐵吸收[24-25]。已有研究表明，在6-羥基多巴胺處理的小膠質(zhì)細(xì)胞中，二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1和IRP1表達(dá)增加，hepcidin表達(dá)降低，F(xiàn)PN1表達(dá)無明顯變化，F(xiàn)PN1無明顯變化可能與IRP1表達(dá)增加和hepcidin表達(dá)降低有關(guān)[26]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未分化的MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞用100 μmol/L FAC處理后TfR1蛋白表達(dá)下降，F(xiàn)PN1蛋白表達(dá)不變，F(xiàn)PN1蛋白表達(dá)不變可能與hepcidin表達(dá)增多和IRP1表達(dá)下降共同調(diào)節(jié)有關(guān)。

綜上所述，高鐵環(huán)境下少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TfR1表達(dá)下降，F(xiàn)PN1表達(dá)不變，鐵轉(zhuǎn)入降低，鐵轉(zhuǎn)出不變，以防止細(xì)胞鐵聚集。本文結(jié)果為PD的治療提供了新的思路和靶點(diǎn)。