解曉曼,胡子凡,楊妍卿,陳文芳

(青島大學基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系，山東 青島 266071)

研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)炎癥在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制中起關鍵作用，小膠質細胞和星形膠質細胞過度激活釋放的炎性因子可導致神經(jīng)元損傷[1-2]。因此，有效抑制小膠質細胞和星形膠質細胞的過度活化是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥防治的有效策略[3]。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)在肝臟中合成，可通過血-腦脊液屏障進入腦內，而腦內的神經(jīng)元、小膠質細胞和星形膠質細胞也可以合成分泌IGF-1[4-5]。AYADI等[6]證實，IGF-1通過激活磷酸激酶對抗6-羥多巴胺誘導的多巴胺能神經(jīng)元的進行性丟失，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。PARK等[7]報道，IGF-1可通過抑制炎癥反應對抗脂多糖(LPS)誘導的小鼠抑郁行為。本課題組前期研究表明，IGF-1能夠抑制1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導的大鼠中腦星形膠質細胞炎癥反應，其機制與IGF-1受體(IGF-1R)和G蛋白偶聯(lián)雌激素膜受體介導的信號途徑有關[8]。淫羊藿素(ICT)是淫羊藿總黃酮主要活性成分淫羊藿苷的衍生物，屬于植物雌激素，具有抗炎、抗氧化和提高免疫力的功效[9-10]。本課題組前期研究證實，ICT能夠顯著抑制LPS誘導的大鼠原代皮質和中腦星形膠質細胞炎癥因子的釋放，應用IGF-1R特異性阻斷劑能夠阻斷ICT的抗炎作用，提示IGF-1R介導的信號途徑參與了ICT的抗炎作用?；贗GF-1和ICT在星形膠質細胞炎癥反應中的抑制作用均與IGF-1R有關，本研究旨在探討IGF-1和ICT是否能夠抑制LPS誘導的BV2小膠質細胞炎癥反應，以及二者合用的抗炎作用是否比單獨用藥更有效?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料

LPS購自美國Sigma公司；ICT購自上海同田生物公司；BV2小膠質細胞屬于小鼠小膠質瘤細胞系，購自北京市協(xié)和醫(yī)學院細胞資源中心；IGF-1購自BioVision公司；DMEM購自Gibco公司；青霉素/鏈霉素儲存液購自新華制藥廠，分裝后-20 ℃保存?zhèn)溆?；胎牛血清購自Hyclone公司，分裝后于-40 ℃保存?zhèn)溆?；TRIzol試劑購自美國Life Technologies公司； PCR逆轉錄試劑盒購自Roche公司；SYBR Green購自美國TaKaRa公司；PCR引物由TaKaRa公司設計并合成。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

將BV2小膠質細胞接種于培養(yǎng)瓶或12孔板中，應用高糖DMEM培養(yǎng)液(含100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和體積分數(shù)0.10胎牛血清)，置含體積分數(shù)0.05 CO2的37 ℃無菌培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。光學顯微鏡觀察細胞融合度達到80%～90%時進行分組和加藥處理。將細胞分為對照組(A組)、LPS組(B組)、IGF-1+LPS組(C組)、ICT+LPS組(D組)和IGF-1+ICT+LPS組(E組)。各組細胞均給予1 μL二甲基亞砜(DMSO)處理；LPS組細胞加入LPS(1 mg/L)作用6 h；IGF-1+LPS組、ICT+LPS組和IGF-1+ICT+LPS組細胞分別加入IGF-1(12.5 μg/L)、ICT(10 μmol/L)、IGF-1(12.5 μg/L)+ICT(10 μmol/L)預保護1 h，再加入LPS(1 mg/L)共同作用6 h。

1.3 實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測環(huán)氧合酶-2(COX-2)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表達

向12孔板中每孔加入500 μL TRIzol裂解細胞，提取總RNA。按照TaKaRa試劑盒說明書配制兩步法反應體系，將RNA逆轉錄為cDNA。配制20 μL的PCR反應體系(包括SYBR Green染料10.0 μL，RNA free water 8.2 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 1.0 μL)，將此反應體系放入RT-PCR儀中進行擴增。經(jīng)過40個循環(huán)完成擴增后，采用2-△△CT法計算目的基因COX-2、iNOS的相對表達量(以GAPDH為內參照)。PCR擴增引物及其序列見表1。

表1 PCR引物及其序列

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

與對照組相比，LPS組細胞炎性因子COX-2和iNOS的mRNA表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(F=20.77、39.85，P<0.05)。析因設計方差分析顯示，IGF-1和ICT兩種藥物存在交互作用(F=18.13、28.11，P<0.05)。主效應分析顯示，IGF-1和ICT預處理均可顯著下調LPS誘導的BV2小膠質細胞COX-2和iNOSmRNA的表達，且IGF-1和ICT聯(lián)合用藥的下調作用比單獨應用兩種藥物更顯著(F=54.84～241.68，P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞COX-2和iNOS mRNA表達水平比較

3 討 論

小膠質細胞是腦內的巨噬細胞，靜息狀態(tài)的小膠質細胞在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮免疫監(jiān)視作用，能夠保護神經(jīng)元；而過度激活的小膠質細胞則會引發(fā)神經(jīng)炎癥，導致神經(jīng)元損傷[11]。當腦內受到炎癥刺激時，小膠質細胞被首先激活，過度激活的小膠質細胞會釋放促炎因子損傷神經(jīng)元并激活星形膠質細胞，過度激活的星形膠質細胞進一步加重神經(jīng)元損傷，提示小膠質細胞和星形膠質細胞的過度激活在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[12]。

IGF-1作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞生長和增殖、神經(jīng)發(fā)生、細胞遷移等生理過程[13-15]。同時，IGF-1也能夠對抗缺血低氧、神經(jīng)毒素等對神經(jīng)元的損傷[16-17]。GRINBERG等[18]應用大鼠海馬腦片研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1能夠通過抑制小膠質細胞氧化應激和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)信號途徑，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。ICT是由淫羊藿苷經(jīng)人體腸道代謝生成的小分子化合物，能夠改善阿爾茨海默病模型小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)線粒體的損傷[19-20]。WU等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導的小鼠帕金森病模型中，ICT通過抑制NLRP3炎性小體的激活，減少白細胞介素-1β的分泌，從而減輕神經(jīng)炎癥。本課題組的前期研究證實，IGF-1通過IGF-1R/PI3-K/MAPK信號通路對抗1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導的大鼠中腦星形膠質細胞的炎癥反應。在原代皮質和中腦星形膠質細胞炎癥模型中，ICT能夠抑制LPS誘導的促炎因子iNOS和TNF-α的基因表達，其抗炎機制可能與IGF-1R信號途徑的激活有關[22-23]。

為進一步探討IGF-1、ICT及二者合用對小膠質細胞炎癥反應的影響，本研究應用LPS誘導BV2小膠質細胞建立神經(jīng)炎癥模型。本課題組前期研究表明，12.5 μg/L的IGF-1可抑制MPP+誘導的原代星形膠質細胞iNOS和COX-2的表達；ICT對LPS誘導的星形膠質細胞iNOS和COX-2的表達也有劑量依賴性的抑制作用，以10 μmol/L的ICT炎癥抑制作用最佳。故本研究應用上述濃度的IGF-1和ICT，分別檢測兩種藥物單用和聯(lián)合應用對LPS誘導的BV2小膠質細胞iNOS和COX-2mRNA表達的影響。結果顯示，IGF-1和ICT均可以顯著抑制iNOS和COX-2mRNA表達，二者合用的抗炎作用更加顯著。IGF-1R是一種酪氨酸激酶受體，被配體激活后，可以通過其下游的PI3-K和Ras-Raf-MEK信號途徑，促進細胞有絲分裂、增殖和存活等。雌激素受體(ER)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)也有廣泛表達，大量研究顯示，ER與IGF-1R介導的信號途徑具有交互作用[24-25]。AZCOITIA等[26]利用海藻酸誘導的去卵巢雌性大鼠海馬損傷模型，研究IGF-1和雌二醇對海馬神經(jīng)元保護作用的機制，結果表明，雌二醇的神經(jīng)保護作用同時依賴于ER和IGF-1R，而IGF-1的保護作用也依賴于ER。在帕金森病的實驗模型中，ER和IGF-1R可以通過交互作用保護神經(jīng)元[27-28]。在6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導的去卵巢雌性大鼠帕金森病模型中，皮下注射雌激素或IGF-1可顯著抑制6-OHDA誘導的黑質致密帶神經(jīng)元損失和紋狀體中酪氨酸羥化酶的免疫反應性，改善大鼠前肢運動障礙，而IGF-1R拮抗劑JB-1可阻斷雌激素或IGF-1的上述神經(jīng)保護作用[29]。在老年去卵巢動物模型中，雌激素已被證明能改善記憶功能，該效應可被JB-1消除，表明雌激素可能通過IGF-1R信號通路發(fā)揮部分作用[30]。ICT是一種植物雌激素，它可能通過ER和IGF-1R信號途徑的交互作用，與IGF-1共同激活下游的信號分子發(fā)揮抗炎作用，其詳細的信號途徑還有待于進一步探討。

綜上所述，IGF-1和ICT均能明顯抑制LPS誘導的BV2小膠質細胞炎癥反應，且二者聯(lián)合應用較單獨應用更有效。