曹中凱,陳鳳華,謝俊霞,石麗敏

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，主要病理特征為黑質(zhì)致密帶多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失及紋狀體軸突末梢多巴胺含量減少[1-3]。PD病人可出現(xiàn)靜止性震顫、肌僵直及運(yùn)動遲緩等多種運(yùn)動癥狀及便秘、睡眠障礙等多種非運(yùn)動癥狀[4-5]。近年來，越來越多的臨床研究表明，在未定帶進(jìn)行深部電刺激能夠改善PD病人的運(yùn)動癥狀[6-8]。未定帶位于丘腦腹側(cè)，被認(rèn)為是底丘腦的一部分，主要分為頭端、背側(cè)、腹側(cè)和尾側(cè)四部分，其中背側(cè)和腹側(cè)是其中心區(qū)域，主要分布一氧化氮合酶(NOS)陽性神經(jīng)元和小清蛋白(PV)陽性神經(jīng)元[9-10]。盡管臨床證據(jù)提示未定帶與PD密切相關(guān)，然而在PD發(fā)病過程中，未定帶PV及NOS陽性神經(jīng)元的數(shù)目是否發(fā)生改變目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)選用經(jīng)典神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)制備PD小鼠模型，通過免疫熒光技術(shù)觀察MPTP對未定帶PV及NOS陽性神經(jīng)元數(shù)目的影響，為了解未定帶在 PD 進(jìn)展和治療中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑

選擇SPF級雄性C57BL/6小鼠，7周齡，體質(zhì)量(22±2)g，購自北京維通利華公司。小鼠飼養(yǎng)于25 ℃、晝夜循環(huán)光照條件下，可自由飲水、攝食、活動，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境1周。MPTP購自美國Sigma公司，酪氨酸羥化酶(TH)抗體購于美國Millipore公司，PV抗體購于美國Abcam公司，NOS抗體和驢抗兔二抗購于美國Thermo Fisher公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 分組及給藥方法

將小鼠隨機(jī)分為對照組和MPTP組，每組6只。MPTP組小鼠給予MPTP連續(xù)5 d腹腔注射，劑量為30 mg/(kg·d)；對照組則以等量生理鹽水代替MPTP。

1.3 腦標(biāo)本采集

麻醉小鼠后，固定其四肢，暴露心臟，將靜脈注射針頭小心插入左心室同時(shí)剪開右心耳。先后用9 g/L NaCl及40 g/L多聚甲醛溶液(用0.1 mol/L PBS配制，pH值7.2～7.4，現(xiàn)用現(xiàn)配，4 ℃避光保存)對小鼠進(jìn)行灌注。待小鼠肝臟由紅色變?yōu)辄S白且四肢和尾部僵直時(shí)，停止灌注操作。取出小鼠的大腦，用40 g/L多聚甲醛溶液固定過夜，再先后用200 g/L及300 g/L蔗糖溶液(0.1 mol/L PBS配制)脫水，待大腦沉底，脫水完成。

1.4 腦組織切片及免疫熒光染色

用恒溫冷凍切片機(jī)(Leica，CM1950)進(jìn)行冷凍切片。切片時(shí)，提前30 min開機(jī)進(jìn)行機(jī)器預(yù)冷，并將腦組織用包埋劑OCT(Sakura Finetek)包埋、固定在凍頭托上。將小鼠腦組織切成厚度為20 μm的腦片，黑質(zhì)及未定帶兩個(gè)部位的腦片分別按先后順序切成完整的4套，將腦片置于含有0.01 mol/L PBS溶液的12孔板中，每次進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)時(shí)取出完整的1套進(jìn)行染色。染色時(shí)，將腦片取出，用40 g/L多聚甲醛溶液固定5 min，以PBS清洗3次(每次10 min)，用含體積分?jǐn)?shù)0.05驢血清(Jackson)的PBST緩沖液室溫封閉1 h，加一抗4 ℃冰箱孵育過夜。次日，用PBS清洗3次，每次10 min；加PBST稀釋的熒光二抗室溫孵育2 h；用PBS清洗3次，每次10 min；用體積分?jǐn)?shù)0.70的甘油(ddH2O配制)封片，避光保存。實(shí)驗(yàn)中用到的一抗分別為anti-nNos (1∶300，rabbit)、anti-parvalbumin (1∶100，rabbit)和anti-tyrosine hydroxylase(1∶1 000，rabbit)；實(shí)驗(yàn)中用到的二抗分別為donkey anti-rabbit488和donkey anti-rabbit 555，稀釋比為1∶500。在Olympus光學(xué)顯微鏡下拍片，應(yīng)用OlyVIA軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于染色的是4套腦片中的1套，故先計(jì)數(shù)該套腦片在20倍物鏡下未定帶及黑質(zhì)區(qū)陽性神經(jīng)元個(gè)數(shù)，再乘以4即可得到未定帶NOS、PV陽性神經(jīng)元和黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元的個(gè)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

與對照組相比較，MPTP組黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.888，P<0.01)；未定帶PV陽性神經(jīng)元和NOS陽性神經(jīng)元數(shù)目均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.618、15.390，P<0.01)。見表1。

表1 兩組小鼠TH、PV和NOS陽性神經(jīng)元數(shù)目比較

3 討 論

未定帶是底丘腦的重要核團(tuán)，處于大腦神經(jīng)軸的中央位置，位于丘腦底核和大腦腳的背側(cè)、內(nèi)側(cè)丘系的外側(cè)[11]。未定帶與皮質(zhì)、中腦、下丘腦、腦干、脊髓等多個(gè)腦區(qū)存在廣泛的投射，參與機(jī)體多種功能的調(diào)控，影響攝食、姿勢與運(yùn)動、睡眠與覺醒、大腦皮質(zhì)發(fā)育、神經(jīng)病理痛等多種生理病理過程[12-21]。近年來，越來越多的臨床研究顯示，在未定帶進(jìn)行深部電刺激后PD病人的震顫、運(yùn)動遲緩等癥狀得到有效緩解，其效果等同于或者優(yōu)于傳統(tǒng)的丘腦底核電刺激，且無明顯副作用，術(shù)后病人認(rèn)知、吞咽及語言功能均未受影響，提示未定帶是治療PD的安全有效的作用靶點(diǎn)[22-28]。神經(jīng)病毒示蹤顯示，未定帶與基底神經(jīng)核諸多核團(tuán)之間存在投射關(guān)系，它接受來自黑質(zhì)網(wǎng)狀帶/蒼白球內(nèi)側(cè)部的抑制性γ-氨基丁酸(GABA)輸入以及黑質(zhì)致密帶的多巴胺能投射，同時(shí)發(fā)出興奮性谷氨酸能投射到黑質(zhì)致密帶，因此也被建議納入基底神經(jīng)核的范疇[29-31]。盡管臨床研究和基礎(chǔ)解剖聯(lián)系均提示未定帶與PD密切相關(guān)，然而目前未定帶參與PD病變的具體神經(jīng)細(xì)胞機(jī)制尚不清楚。

本研究關(guān)注的是未定帶NOS和PV陽性神經(jīng)元。未定帶以GABA能神經(jīng)元為主，但細(xì)胞異質(zhì)性強(qiáng)，由于神經(jīng)化學(xué)標(biāo)志物的表達(dá)不同又分為多種亞型。其中，NOS陽性神經(jīng)元主要分布在背側(cè)未定帶，PV陽性神經(jīng)元集中分布在腹側(cè)未定帶，背側(cè)和腹側(cè)構(gòu)成了未定帶的中心區(qū)域。這些不同亞型的GABA能神經(jīng)元與不同核團(tuán)之間存在廣泛的纖維投射，參與機(jī)體對多種運(yùn)動行為的調(diào)節(jié)。例如，激活未定帶PV陽性神經(jīng)元-丘腦后內(nèi)側(cè)核團(tuán)環(huán)路可以增強(qiáng)聲音誘導(dǎo)的逃跑行為[14]；前扣帶回皮質(zhì)-未定帶NOS陽性神經(jīng)元環(huán)路參與了小鼠探索運(yùn)動的調(diào)控[32]。為驗(yàn)證PD過程中未定帶的PV及NOS陽性神經(jīng)元的數(shù)量是否會發(fā)生改變，本研究利用經(jīng)典神經(jīng)毒素MPTP制備PD小鼠模型，首先通過免疫熒光技術(shù)檢測到黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元數(shù)目減少，證實(shí)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷，PD模型建立成功，進(jìn)而觀察到未定帶NOS和PV陽性神經(jīng)元數(shù)目較對照組顯著減少。

然而，神經(jīng)化學(xué)標(biāo)志物NOS和PV的表達(dá)為何受到影響目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用連續(xù)5 d腹腔注射MPTP方法制備亞急性PD小鼠模型。MPTP是一種經(jīng)典的神經(jīng)毒素，其本身沒有毒性，但極易通過血-腦脊液屏障，進(jìn)入腦內(nèi)后在單胺氧化酶B的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镸PP+，后者經(jīng)細(xì)胞膜上的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入多巴胺能神經(jīng)元，阻斷線粒體電子傳遞系統(tǒng)，導(dǎo)致能量代謝障礙和自由基的生成增加，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元損傷[33-34]。我們推測，黑質(zhì)致密帶多巴胺能神經(jīng)元的丟失可能會影響到從黑質(zhì)致密帶到未定帶的多巴胺能投射，進(jìn)而抑制未定帶中PV、NOS陽性神經(jīng)元這兩種GABA能神經(jīng)元的表達(dá)。此外，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷也可以引起其他多個(gè)腦區(qū)神經(jīng)元電活動的異常，如皮質(zhì)和腳橋核，而這兩個(gè)核團(tuán)與未定帶也有密切的纖維投射[25,35-37]。因此，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元可能通過上述直接或者間接投射，影響了未定帶PV及NOS陽性神經(jīng)元的數(shù)目變化。本實(shí)驗(yàn)初步觀察了PD中未定帶區(qū)域PV陽性神經(jīng)元及NOS陽性神經(jīng)元的數(shù)目變化，為闡明PD影響未定帶神經(jīng)元的病理表達(dá)提供了初步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。