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        基于高通量測(cè)序的清水竹筍加工關(guān)鍵環(huán)節(jié)細(xì)菌污染狀況分析

        2022-08-05 07:29:26戴奕杰湯嬌嬌
        糧食科技與經(jīng)濟(jì) 2022年3期

        戴奕杰,湯嬌嬌,李 珂

        (1.貴陽(yáng)學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550005;2.貴州省山地珍稀動(dòng)物與經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550005;3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410125)

        竹筍廣泛分布于中國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)。因其具有的生長(zhǎng)季節(jié)性限制,新鮮竹筍并不能得到全年供應(yīng),而采后迅速木質(zhì)化降低了新鮮竹筍的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和適口性。同時(shí),新鮮竹筍會(huì)發(fā)生褐變或變黃,尤其集中體現(xiàn)在采收時(shí)的切面。采后貯藏措施可以延長(zhǎng)竹筍的貨架期,但不能保證竹筍的全年供應(yīng)。為此,對(duì)新鮮竹筍進(jìn)行不同的加工處理是必要的,包括發(fā)酵、煮沸、熱燙、罐裝和腌制。其中,罐裝、干燥和發(fā)酵最為常見(jiàn)[1]。竹筍在剝殼、挑選、整形等加工環(huán)節(jié)必然會(huì)產(chǎn)生以筍殼、筍頭以及預(yù)煮水等為主的廢棄物,這些廢棄物堆積后若得不到及時(shí)處理,微生物生長(zhǎng)繁殖加劇,將污染竹筍加工廠周圍環(huán)境。

        食源性疾病是指通過(guò)攝食而進(jìn)入人體的有毒有害物質(zhì)等致病因子所造成的疾病。可分為感染性和中毒性,包括常見(jiàn)的食物中毒、腸道傳染病、人畜共患傳染病、寄生蟲(chóng)病以及化學(xué)性有毒有害物質(zhì)所引起的疾病[2]。根據(jù)竹筍加工廠的竹筍預(yù)處理過(guò)程,在新鮮竹筍剝殼后極易受到操作者攜帶的病菌污染,隨后進(jìn)行預(yù)煮環(huán)節(jié)[3],雖經(jīng)過(guò)高溫處理,但仍有耐熱致病菌芽孢存在,二次供水的清潔程度也會(huì)直接影響竹筍制品安全性,進(jìn)入操作臺(tái)后工作人員在挑選、整形過(guò)程的不當(dāng)操作也可能導(dǎo)致竹筍制品的安全隱患。

        本研究擬對(duì)竹筍加工廠二次供水及竹筍分割整形操作臺(tái)上竹筍殘?jiān)M(jìn)行采樣,通過(guò)菌落總數(shù)測(cè)定、16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)合Tax4Fun功能預(yù)測(cè)分析該竹筍加工廠微生物污染情況,重點(diǎn)關(guān)注與人類疾病密切相關(guān)致病菌的相對(duì)豐度及基因表達(dá)狀況,為竹筍加工廠食源性疾病的預(yù)防提供理論依據(jù),并提出相應(yīng)對(duì)策建議。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

        竹筍加工廠二次供水以及操作臺(tái)上竹筍邊角料等竹筍殘?jiān)汉夏持窆S加工企業(yè);NaCl(分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基:廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        NovaSeq6000型高通量測(cè)序分析儀:美國(guó)Illumina公司;AxyPrep DNA Gel Extraction Kit:美國(guó)Axygen Biosciences公司;QuantiFluor?-ST:美國(guó)Promega公司;TS-2102C型立式恒溫振蕩器:上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司;XK97-A型菌落計(jì)數(shù)器:姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增

        采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)方法對(duì)樣本的基因組脫氧核糖核酸(DNA)進(jìn)行提取,之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度,取適量的樣本DNA于離心管中,使用無(wú)菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板,選擇通用引物 515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和 806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 擴(kuò)增DNA中V3、V4區(qū)域。使用帶Barcode的特異引物,New England Biolabs 公 司 的 Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。

        1.3.2 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

        PCR產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè);對(duì)檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化,采用酶標(biāo)定量,根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣,充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,對(duì)目的條帶使用荷蘭Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

        1.3.3 文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序

        使 用 TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit和Q-PCR定量,文庫(kù)合格后,使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

        1.3.4 菌落總數(shù)測(cè)定

        菌落總數(shù)測(cè)定依據(jù)GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行。具體步驟:無(wú)菌條件下稱取25 mL二次供水以及25 g竹筍殘?jiān)鼧悠酚?25 mL具有適量無(wú)菌玻璃珠的生理鹽水中,在恒溫振蕩器(120 r/min)震蕩2 min后,用生理鹽水進(jìn)行稀釋。取10-1和10-2稀釋度樣品各1 mL,分別用(46±1) ℃的滅菌平板計(jì)數(shù)瓊脂15~20 mL傾注平皿,轉(zhuǎn)動(dòng)混勻,每個(gè)稀釋度傾注兩個(gè)平皿。待瓊脂凝固后倒置平板,經(jīng)(36±1)℃培養(yǎng)(48±2)h后,用放大鏡和菌落計(jì)數(shù)器記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量,菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位(CFU)表示,每批次樣品檢測(cè)3份。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 菌落總數(shù)

        通過(guò)對(duì)竹筍加工廠二次供水和竹筍殘?jiān)淇倲?shù)檢測(cè),二次供水中檢測(cè)到菌落總數(shù)為1.5×102CFU/mL,竹筍殘?jiān)袡z測(cè)到的菌落總數(shù)為9.2×103CFU/g,可以發(fā)現(xiàn)竹筍殘?jiān)⑸锟偭扛?,受污染更?yán)重。

        2.2 細(xì)菌序列豐度及多樣性分析

        如圖1(a)所示,所有樣品曲線形狀相似均趨于平坦,說(shuō)明6個(gè)樣品細(xì)菌組成均勻程度相近。如圖1(b)所示,6個(gè)樣品的曲線均趨于平坦,說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)足以覆蓋所有的細(xì)菌,表明6個(gè)樣品中細(xì)菌具有多樣性。二次供水的Shannon指數(shù)[圖1(c)]和Simpson指數(shù)[圖1(d)]均高于竹筍殘?jiān)?,說(shuō)明二次供水中的細(xì)菌多樣性高于竹筍殘?jiān)?,而且ACE指數(shù)[圖1(e)]和Chao1[圖1(f)]越高表明二次供水的物種豐富,分配更均勻。

        圖1 竹筍殘?jiān)岸喂┧男蛄胸S度及Alpha-多樣性

        2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

        Venn圖可以更加直觀的表現(xiàn)出樣品獨(dú)有和共有的操作單元(OUT)數(shù)目,表現(xiàn)樣本的OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況。圖2為竹筍加工廠二次供水及竹筍殘?jiān)蠴TU數(shù)目的重疊情況,重疊OTU數(shù)目為79,占總OTU數(shù)目的56.43%,二次供水和竹筍殘?jiān)?dú)有的OTU數(shù)目分別為40和21,占總OTU數(shù)目的28.57%、15.00%,說(shuō)明兩個(gè)樣本間微生物之間存在一定相似性。

        圖2 OUT水平上的Venn圖

        主坐標(biāo)分析(PCoA)是通過(guò)一系列的特征值和特征向量排序從多維數(shù)據(jù)中提取出最主要的元素和結(jié)構(gòu)[4]。本研究基于Weighted Unifrac距離來(lái)進(jìn)行PCoA分析,并選取貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合進(jìn)行作圖展示。由圖3可以看出,竹筍加工廠二次供水和竹筍殘?jiān)M內(nèi)三點(diǎn)之間呈現(xiàn)明顯聚集狀態(tài),說(shuō)明組內(nèi)菌落結(jié)構(gòu)差異較??;而二次供水與竹筍殘?jiān)鼉蓸悠方M間距離相差較大,說(shuō)明竹筍加工廠二次供水和竹筍殘?jiān)g菌落結(jié)構(gòu)有一定差異。

        圖3 基于Unweighted UniFrac距離的PCoA圖

        2.4 物種相對(duì)豐度柱狀圖

        如圖4所示,竹筍水及竹筍廢棄物中相對(duì)豐度排名前15的細(xì)菌為巴黎鏈球菌、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、食竇魏斯氏菌(Weissella cibaria)、乳酸明串珠菌、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、大腸桿菌、棉籽糖乳球菌(Lactococcusraffinolactis)、武侯氏不動(dòng)桿菌、鯨魏斯氏菌(Weissellaceti)、炭疽芽孢桿菌、格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)、加納魏氏菌(Weissella ghanensis)、睪酮假單胞菌(Comamonastestosteroni)、熱死索絲菌(Brochothrixthermosphacta)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)。

        圖4 細(xì)菌屬水平、種水平相對(duì)豐度柱狀圖

        巴黎鏈球菌是一種條件致病菌,可能具有毒力島和致病基因[5],可通過(guò)入侵腸道導(dǎo)致兒童腹瀉。Marmolin等[6]研究了鏈球菌的不同亞種對(duì)人類感染性心內(nèi)膜炎和胃腸道疾病之間的可能聯(lián)系,強(qiáng)調(diào)了巴黎鏈球菌導(dǎo)致的菌血癥患者的1年致死率達(dá)到66.7%。此外,診斷為巴黎鏈球菌導(dǎo)致菌血癥的患者中,26.3%患有癌癥,并且這些癌癥中的80%在胃腸系統(tǒng)之外,除非進(jìn)行諸如核磁共振成像或正電子發(fā)射斷層掃描之類的檢查,否則難以診斷。王麗君[7]從乳房發(fā)炎的奶牛乳樣中通過(guò)16S rRNA基因克隆測(cè)序確定巴黎鏈球菌2株,表明巴黎鏈球菌是潛在導(dǎo)致奶牛乳腺炎的致病菌,這與Chen等[8]對(duì)患乳腺炎奶牛分離的巴黎鏈球菌研究相一致。Almuzara等[9]研究表明巴黎鏈球菌可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)侵襲,而隨后侵入宿主細(xì)胞保護(hù)細(xì)菌免受抗菌劑的侵害,并導(dǎo)致慢性感染的發(fā)展。巴黎鏈球菌在二次供水和竹筍殘?jiān)衅骄鄬?duì)豐度分別為0.207和0.554,均占據(jù)首位。

        不動(dòng)桿菌是一類革蘭氏陰性菌[10],其中某些菌種是條件致病菌。有關(guān)武侯氏不動(dòng)桿菌研究較少,該菌于2018年被Hu等[11]首次檢測(cè)出,其病理學(xué)作用機(jī)制仍需進(jìn)一步挖掘研究。熱死索絲菌為革蘭氏陽(yáng)性微需氧無(wú)芽孢菌[12],主要存在于肉制品中,是真空、冷凍包裝肉制品主要腐敗菌之一[13-14]。大腸桿菌是常見(jiàn)病原菌,呈革蘭氏陰性,存在于生物腸道內(nèi),在一定條件下可以引起人體發(fā)生胃腸道感染或尿道等多種局部組織器官感染[15],在竹筍加工廠二次供水中平均相對(duì)豐度為0.013 0,居于第6位,在竹筍殘?jiān)衅骄鄬?duì)豐度為0.003 8,居于第8位。炭疽芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌,芽孢抗毒性強(qiáng),可導(dǎo)致家畜、人類患炭疽病。在二次供水及竹筍殘?jiān)衅骄鄬?duì)豐度分別為0.001 8、0.000 5。

        2.5 Tax4Fun功能預(yù)測(cè)

        Tax4Fun功能預(yù)測(cè)是通過(guò)基于最小16S rRNA序列相似度的最近鄰居法實(shí)現(xiàn)的[16],其具體做法為提取KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)原核生物全基因組16S rRNA基因序列并利用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)算法將其比對(duì)到SILVA SSU Ref NR數(shù)據(jù)庫(kù)(BLAST bitscore>1 500)建立相關(guān)矩陣,將通過(guò)UProC和PAUDA兩種方法注釋的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)原核生物全基因組功能信息對(duì)應(yīng)到SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)中,實(shí)現(xiàn)SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋。測(cè)序樣品以SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)序列為參考序列聚類出OTU,進(jìn)而獲取功能注釋信息。

        如圖5所示,二次供水及竹筍殘?jiān)谢墚愷B(yǎng)型生物及發(fā)酵作用基因表達(dá)平均值較高,化能異養(yǎng)生物可分為腐生型和寄生型[17],腐生型可從無(wú)生命有機(jī)物獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),會(huì)引起食品腐敗變質(zhì),如毛霉、根霉以及芽胞桿菌[18]等。寄生型生物必須寄生在活的有機(jī)體內(nèi),從寄主體內(nèi)獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[19],能夠引起動(dòng)植物的微生物病害,如普遍存在的鏈球菌和大腸桿菌。發(fā)酵作用微生物主要以乳球菌、乳桿菌以及明串珠菌占優(yōu)勢(shì),且竹筍殘?jiān)l(fā)酵作用極顯著高于二次供水(P=0.007)。二次供水中表達(dá)量高且顯著高于竹筍殘?jiān)谋磉_(dá)基因是植物病原體(P<0.001),竹筍殘?jiān)斜磉_(dá)量高且與二次供水具有顯著區(qū)別的基因有人類病原體(P=0.027)以及寄生蟲(chóng)(P=0.027)。

        圖5 KEGG聚類T-Test分析圖

        3 結(jié)論與討論

        本文針對(duì)竹筍加工廠二次供水及竹筍殘?jiān)M(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定,發(fā)現(xiàn)竹筍殘?jiān)芯淇倲?shù)顯著高于二次供水,表明竹筍殘?jiān)芪⑸镂廴緡?yán)重。通過(guò)16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序分析、Venn圖和PCoA分析表明竹筍加工廠二次供水和竹筍殘?jiān)⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)具有一定的相似性,可能是竹筍殘?jiān)L(zhǎng)時(shí)間堆放發(fā)酵,微生物快速生長(zhǎng)繁殖,導(dǎo)致工廠周圍水資源中的微生物群落結(jié)構(gòu)改變,并趨于一致。物種相對(duì)豐度圖中顯示竹筍加工廠二次供水和竹筍殘?jiān)衪op5細(xì)菌為巴黎鏈球菌、乳酸乳球菌、食竇魏斯氏菌、乳酸明串珠菌、發(fā)酵乳桿菌。其中巴黎鏈球菌已經(jīng)被證明可通過(guò)食物進(jìn)入人體腸道,入侵宿主細(xì)胞保護(hù)致病菌,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)侵害,誘導(dǎo)腹瀉、痢疾等腸道疾病。本研究發(fā)現(xiàn)巴黎鏈球菌在竹筍殘?jiān)械南鄬?duì)豐度高于二次供水,推測(cè)竹筍殘?jiān)前屠桄溓蚓饕獊?lái)源。二次供水和竹筍殘?jiān)羞€具有其他相對(duì)豐度較高的條件致病菌,如武侯氏不動(dòng)桿菌、熱死索絲菌、大腸桿菌、炭疽芽孢桿菌等均可能通過(guò)食物導(dǎo)致人體患腸道、皮膚疾病。進(jìn)一步通過(guò)Tax4Fun功能預(yù)測(cè)分析二次供水及竹筍殘?jiān)信c致病微生物基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)的功能特性,發(fā)現(xiàn)二次供水及竹筍殘?jiān)谢墚愷B(yǎng)型生物基因表達(dá)量最高,通常以寄生細(xì)菌為主,特別是相對(duì)豐度較高的巴黎鏈球菌。二次供水植物病原體基因表達(dá)量顯著高于竹筍殘?jiān)?,而竹筍殘?jiān)腥祟惒≡w及寄生蟲(chóng)相關(guān)基因表達(dá)量高于二次供水,表明二次供水及竹筍殘?jiān)芯袑?duì)人體有害微生物,并且其基因表達(dá)量較高,直接影響竹筍加工制品安全性[20-21]。

        顯然,竹筍加工廠二次供水及竹筍殘?jiān)谝欢ǔ潭壬鲜艿街虏∥⑸镂廴?。因此,提高企業(yè)衛(wèi)生安全意識(shí),加強(qiáng)衛(wèi)生監(jiān)管工作,有效控制操作人員衛(wèi)生狀況是十分必要的。

        竹筍加工廠二次供水及竹筍殘?jiān)邪l(fā)酵用細(xì)菌相對(duì)豐度較高,通過(guò)Tax4Fun功能預(yù)測(cè)也側(cè)面表明了關(guān)于食品發(fā)酵基因表達(dá)較高,這也為竹筍加工廠提供豐富的微生物資源,可針對(duì)二次供水及竹筍殘?jiān)M(jìn)行微生物培養(yǎng)分離鑒定,將分離得到的具有益生性能的細(xì)菌接種于竹筍殘?jiān)?,從而抑制其他腐敗微生物生長(zhǎng)繁殖,有效控制微生物污染周圍水資源,再將發(fā)酵后竹筍殘?jiān)苽涑汕噘A飼料等進(jìn)行二次利用[22]。因此,將竹筍殘?jiān)皶r(shí)收集并利用乳酸菌發(fā)酵處理,既能夠解決竹筍加工廠水資源微生物污染以及竹筍殘?jiān)瘮“l(fā)臭問(wèn)題,又能提高竹筍加工廠的經(jīng)濟(jì)效益。與此同時(shí),二氧化氯作為新型消毒劑,在果蔬、水產(chǎn)品、飲品中具有高效安全性[23]。竹筍廠在對(duì)二次供水進(jìn)行處理時(shí),可在其中加入0.7 mg/L二氧化氯[24]進(jìn)行殺菌消毒;竹筍整形階段,間隔1 h用二氧化氯水清洗臺(tái)面,可以有效控制微生物污染。

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