任恒杰，王忠利

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

胃癌是消化系統(tǒng)常見的腫瘤之一，多見于中老年人。在我國其發(fā)病率位居常見腫瘤的第二位，死亡率位居第三位，嚴(yán)重威脅人們的健康和生命。胃癌主要是起源于粘膜上皮細(xì)胞，臨床表現(xiàn)為腹脹、噯氣、惡心等缺乏特異性的上消化道癥狀，由于上述表現(xiàn)與胃潰瘍、胃炎等良性疾病癥狀相似而被患者忽視。我國早期胃癌的檢出率較低,臨床確診的病例多為進(jìn)展期胃癌。胃腺癌是最為常見的病理類型，手術(shù)是主要治療方法，但是對于出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)喪失手術(shù)機(jī)會(huì)的患者來說，全身化療是治療的重要方式，但是化療敏感性較差，主要與胃腺癌是高增殖性、高侵襲性腫瘤相關(guān)，而高增殖性及高侵襲性可能貫穿于腫瘤形成和進(jìn)展的始終，也是預(yù)后不良的重要分子因素[1]。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是腫瘤細(xì)胞增殖的重要標(biāo)志因子，常受上游多種基因的調(diào)控[2]。III型纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)域1(FNDC1)是G蛋白β、γ亞基的獨(dú)立輔助性蛋白受體[3]，也是近年人們關(guān)注的與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的因子，可以通過多種途徑促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[4]。本實(shí)驗(yàn)基于胃腺癌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，檢測腫瘤中FNDC1的表達(dá)特征，分析其臨床意義，探討對細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2015年1月至2016年10月期間在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院診斷為胃腺癌，并行根治手術(shù)的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)后切片均病理醫(yī)師復(fù)審進(jìn)一步明確，符合WHO中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前行放、化療者；(2)嚴(yán)重內(nèi)科疾病者；(3)既往有消化系統(tǒng)手術(shù)史。共選擇67例，其中男性35例，女性32例，年齡35～88歲，平均年齡(59.7±6.9)歲，中位年齡59歲。留取術(shù)后腫瘤組織和距腫物邊緣>3 cm的正常胃粘膜組織(石蠟包埋組織)。研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2 細(xì)胞系

選擇的胃癌細(xì)胞株MGC803購于中科院上海細(xì)胞庫。在37 ℃、5%CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，應(yīng)用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在細(xì)胞密度約70%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)。

1.3 免疫組化實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用免疫組化EnVision法檢測腫瘤組織和正常胃粘膜組織中FNDC1、腫瘤組織中PCNA的表達(dá)。FNDC1為濃縮液(K8002)，購自Dako公司，PCNA為濃縮液，購自蘇州睿瀛公司(RLM3031)，不同梯度稀釋后先行預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察，選擇顯色最理想的濃度進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)(FNDC1是1∶50，PCNA是1∶100)，DAB顯色，嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟手工操作，均由同一病理技師完成。

判讀方法：FNDC1和PCNA的陽性部位為腫瘤細(xì)胞核，以黃色、棕黃色及棕褐色為陽性，隨機(jī)選擇5個(gè)400倍視野(熱點(diǎn)區(qū))進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。以陽性率≤25%為陰性，以>26%為陽性。

1.4 細(xì)胞系構(gòu)建

根據(jù)Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑使用說明將人工合成的siRNA-FNDC1小干擾質(zhì)粒和無關(guān)序列轉(zhuǎn)染到MGC-803細(xì)胞中，分別建立siRNA-FNDC1組及空載體轉(zhuǎn)染組，同時(shí)設(shè)立空白對照組。

1.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)

將對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化，制備成細(xì)胞懸液，接種于96 孔板中(>5000個(gè)細(xì)胞/每孔)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞均勻鋪于孔底70%左右時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，孵育24 h后，在避光環(huán)境中加入10 μL的CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后應(yīng)用酶標(biāo)儀測定450 nm波長下各組細(xì)胞的OD值。

1.6 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(RT-qPCR)法檢測PCNA mRNA的表達(dá)。TRIzol提取各組細(xì)胞的總RNA，驗(yàn)證純度。逆轉(zhuǎn)錄法獲得總的cDNA。引物上游：5′-TCTATCGATGATATAAACGAGTTCCGCT-3′，下游：5′-GCTGATAGTAGTAGATGCCCATGCCAG-3′。U6為內(nèi)參，上游：5′-CTACGCTTCGCACAATCAACTGA-3′，下游：5′-GCTGTGCAGCGA GGTATCGT-3′。PCR執(zhí)行程序：95 ℃預(yù)變性30 s后，變性95 ℃ 30 s，退火60 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果以2-ΔΔCt表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)均應(yīng)用SAS 6.12軟件進(jìn)行分析，定量資料行正態(tài)性檢驗(yàn)，兩組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，多組間比較行方差分析，并應(yīng)用SNK法行兩兩比較，率的比較應(yīng)用卡方檢驗(yàn)，應(yīng)用K-M生存分析及線性相關(guān)分析，均以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息分析

GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)數(shù)據(jù)庫行生物信息分析，顯示相對于正常組織，F(xiàn)NDC1在胃腺癌中的表達(dá)可能有增高趨勢，見圖1。

圖1 生物信息分析結(jié)果圖(GEPIA)

2.2 胃腺癌和正常胃粘膜組織中FNDC1陽性率表達(dá)的比較

兩組中FNDC1表達(dá)的陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，即胃腺癌中FNDC1高表達(dá)，見表1、圖2。

表1 胃腺癌和正常胃粘膜組織中FNDC1陽性率的比較[n(%)]

A：FNDC1在胃腺癌中陽性；B：FNDC1在正常胃粘膜組織中陰性圖2 胃腺癌和正常胃粘膜組織中FNDC1的表達(dá)(200×)

2.3 FNDC1在胃腺癌不同臨床特征分組中表達(dá)的比較

胃腺癌中FNDC1的陽性率在不同腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤深度的比較中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 FNDC1在不同臨床特征分組中陽性率的比較[n(%)]

2.4 胃腺癌中FNDC1和PCNA的相關(guān)性

胃腺癌中PCNA的陽性率范圍為5%～85%，平均43.1%。線性相關(guān)分析顯示FNDC1和PCNA的評分具有正相關(guān)性(r=0.65，P=0.023)，見圖3～4。

圖3 PCNA表達(dá)(免疫組化EnVision法)

r=0.65，P=0.023圖4 胃腺癌中FNDC1和PCNA的相關(guān)性

2.5 胃腺癌中FNDC1表達(dá)的生存分析

患者均進(jìn)行術(shù)后60個(gè)月生存時(shí)間的隨訪，應(yīng)用門診、電話及上門隨訪的形式。截止時(shí)間點(diǎn)為2011年10月31日。其中因非胃癌死亡者1例，失訪2例(此3例計(jì)為刪失值)。應(yīng)用K-M生存分析顯示FNDC1與生存時(shí)間有關(guān)(FNDC1陽性率的臨界值為25%，χ2=6.73，P=0.010)，即FNDC1高表達(dá)時(shí)生存時(shí)間短，預(yù)后差；FNDC1低表達(dá)時(shí)生存時(shí)間長，預(yù)后好，見圖5。

圖5 生存分析圖

2.6 不同組別不同時(shí)點(diǎn)胃癌細(xì)胞系中細(xì)胞增殖活性的比較

siRNA-FNDC1組于48 h時(shí)開始細(xì)胞增殖活性明顯低于空白對照組和空載體轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，并持續(xù)至96 h，見圖6。

圖6 不同組別不同時(shí)點(diǎn)胃癌細(xì)胞系中細(xì)胞增殖活性的比較

2.7 不同組別細(xì)胞系中PCNA mRNA表達(dá)的比較

siRNA-FNDC1組PCNA mRNA表達(dá)(1.01±0.23)明顯低于空白對照組(1.50±0.29)和空載體轉(zhuǎn)染組(1.48±0.34)(F=5.94，P=0.001)，見圖7。

*P<0.05圖7 不同組別細(xì)胞系中PCNA mRNA表達(dá)的比較

3 討 論

胃粘膜表面被覆腺上皮細(xì)胞，腺上皮異型增生后形成浸潤性癌[5-6]。癌細(xì)胞具有高增殖活性，且大部分腫瘤的分化差，表現(xiàn)為易于生長和侵襲。胃腺癌病理切片鏡下表現(xiàn)為彌漫性生長，細(xì)胞間連接松散[7-8]。PCNA是經(jīng)典的標(biāo)記增殖指標(biāo)的因子，可以反應(yīng)腺上皮細(xì)胞增殖的活躍程度。FNDC1是近年關(guān)注到的與腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān)的基因，生物信息學(xué)分析其可能與胃腺癌的形成有關(guān)。FNDC1基因全長1894 bp，分子量205 kDa，為一種蛋白編碼與惡性疾病相關(guān)的因子，ABI3BP是基因的產(chǎn)物之一，可以激活G蛋白[9-10]，作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子中正向調(diào)控因子發(fā)揮促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用[11]。

研究結(jié)果顯示胃腺癌組織中FNDC1表達(dá)的陽性率明顯高于對照組，提示FNDC1表達(dá)升高是胃腺癌形成過程中的重要分子事件，即FNDC1具有癌基因樣的作用。結(jié)果顯示胃腺癌中FNDC1的陽性率在不同腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤深度的比較中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示FNDC1高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的生長、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及局部侵襲，F(xiàn)NDC1是腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志因子。FNDC1 具有纖維連接蛋白成份，其是腫瘤形成的調(diào)控因子之一[12]，有研究顯示纖維連接蛋白在腫瘤形成和轉(zhuǎn)移中有重要作用，主要受血管生長因子的調(diào)節(jié)，即FNDC1對腫瘤的血管新生有作用，這為腫瘤組織在生長過程中接受更多血液灌注提供了條件[13]，也為腫瘤生長提供了必要的營養(yǎng)和氧的支持，也加速了腫瘤的侵襲。FNDC1在腫瘤中的作用與增加血管通透性和減少內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡有關(guān)[14]。FNDC1在促進(jìn)腫瘤形成過程中受上下游多種因子的共同調(diào)控，因此其調(diào)控機(jī)制復(fù)雜。顧園等[15]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-6783-3p等非編碼RNA是FNDC1的上游因子，二者具有靶向負(fù)向調(diào)控作用。FNDC1對腫瘤間質(zhì)的調(diào)節(jié)作用可能更強(qiáng)，包括對細(xì)胞外基質(zhì)的降解和細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)等[16-17]。結(jié)果顯示胃腺癌中FNDC1與PCNA具有正相關(guān)性，且經(jīng)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了干擾FNDC1的表達(dá)對細(xì)胞增殖活性形成明顯抑制作用，提示FNDC1促進(jìn)腫瘤形成和進(jìn)展與對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用有關(guān)[18]。結(jié)果顯示FNDC1的表達(dá)與胃腺癌的預(yù)后有關(guān)，提示臨床檢測FNDC1的表達(dá)對判斷預(yù)后可能有一定價(jià)值，這與Zhong等[19]的研究結(jié)論較為一致，但是其臨界值有待后續(xù)進(jìn)行大樣本及多中心性的研究進(jìn)一步明確。

綜上所述，F(xiàn)NDC1在胃腺癌中表達(dá)升高，參與腫瘤的形成和進(jìn)展。FNDC1的作用可能與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)。檢測胃腺癌組織中FNDC1的表達(dá)可能對判斷預(yù)后有一定價(jià)值。