鮑生成 包天杰 王沈同 徐曉雁, 代雅凡 張家華 李家樂, 沈玉幫,

(1.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201306;2.上海海洋大學(xué)上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心,上海 201306)

青魚(Mylopharyngodon piceus)肉味鮮美、生長(zhǎng)快,且具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,是我國(guó)四大家魚之一,在我國(guó)的珠江到長(zhǎng)江、黑龍江都有分布,且在全國(guó)各地廣泛養(yǎng)殖。但是近些年由于生態(tài)環(huán)境的破壞,我國(guó)青魚的野生群體量嚴(yán)重下降[1,2],使得推進(jìn)青魚種質(zhì)資源遺傳多樣性調(diào)查和研究工作尤為重要。線粒體DNA分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,可以自我復(fù)制,不易發(fā)生基因重組,進(jìn)化速率較快。目前為止,已經(jīng)廣泛被應(yīng)用到魚類種群的遺傳結(jié)構(gòu)研究中,且青魚的遺傳進(jìn)化研究中也有了一定的基礎(chǔ)。

付曉艷等[3]最早于2004年對(duì)長(zhǎng)江和珠江水系4個(gè)不同地點(diǎn)54尾青魚樣本的線粒體Cytb基因遺傳多樣性進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)4個(gè)群體的遺傳分化程度和遺傳多樣性水平都較低。謝啟明等[4]運(yùn)用線粒體Cytb基因與D-loop區(qū)兩種分子標(biāo)記分析了3個(gè)青魚養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu),結(jié)果發(fā)現(xiàn)群體間遺傳多樣性較豐富,出現(xiàn)了高度分化,基因交流明顯,且受到純化選擇作用。楊宗英等[5]基于mtDNA序列分析了長(zhǎng)江中游5個(gè)野生青魚群體的遺傳結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)青魚群體可能經(jīng)歷過種群擴(kuò)張事件且各青魚群體間遺傳分化不明顯。王豐等[6,7]使用自主開發(fā)的12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了4個(gè)野生群體及1個(gè)養(yǎng)殖群體青魚的遺傳結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)5個(gè)群體具有較高的遺傳多樣性,養(yǎng)殖群體與4個(gè)野生群體遺傳距離較遠(yuǎn)。

對(duì)青魚遺傳結(jié)構(gòu)的了解是保護(hù)種質(zhì)資源的前提條件。當(dāng)前以對(duì)于線粒體DNA開展青魚的遺傳多樣性研究,主要是以D-loop區(qū)、Cytb基因?yàn)橹?目前尚且沒有以線粒體COⅠ基因?yàn)榉肿訕?biāo)記分析青魚遺傳結(jié)構(gòu)的研究。本研究采用COⅠ基因?yàn)檠芯繀^(qū)域,通過測(cè)序?qū)?個(gè)地理群體共271個(gè)樣本進(jìn)行研究,目的是通過分析群體間的遺傳多樣性和遺傳分化程度,從而調(diào)查青魚目前的種質(zhì)資源狀況和遺傳關(guān)系,為青魚種質(zhì)資源的保護(hù)和創(chuàng)新奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和DNA提取

本研究所用青魚分別收集于湖北石首、湖南湘江、揚(yáng)州邗江、浙江嘉興、江西瑞昌和陜西新民四大家魚原種,以及江蘇吳江、廣東佛山和廣西西埌四大家魚良種場(chǎng)(表1)。將收集到的青魚樣本剪其鰭條,保存在無水乙醇中并儲(chǔ)存在-20℃冰箱。

表1 九個(gè)青魚群體采集信息Tab.1 Sampling Information of nine populations of M.piceus

使用pall corporation的96孔過濾板進(jìn)行DNA的提取[8],使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度,分光光度計(jì)Nanodrop 2000(Thermo Scientific,美國(guó))檢測(cè)A260/280值及濃度。

1.2 COⅠ基因序列引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI中MT084757的COⅠ序列,使用Primier6設(shè)計(jì)引物,驗(yàn)證其特異性后,交至上海生工生物公司合成。引物序列為5′-GGAATAGT GGGAACCGCTCT-3′和5′-GATGGCAAATACGGC ACCTA-3′。

PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系20 μL,包含2×TaqPCR MasterMix(含染料) 10 μL,ddH2O 6.5 μL,上下游引物各(濃度為10 μmol/L)1 μL,模板DNA 1.5 μL。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s,52℃退火30s,72℃延伸15s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min,4℃保存。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Sequencher 5.4.6[9]軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行多序列對(duì)比,使用DNASP5.0[10]軟件分析群體的突變位點(diǎn)(S)、單倍型數(shù)(H)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)、平均核苷酸差異數(shù)(K)、基因流(Nm),Network 5.0軟件進(jìn)行單倍型網(wǎng)絡(luò)圖的繪制,Arlequin3.5[11]軟件計(jì)算遺傳分化指數(shù)、分子方差變異(AMOVA)分析,使用MEGA 5.0[12]軟件進(jìn)行群體間遺傳距離的計(jì)算及進(jìn)化樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 序列分析

對(duì) 9個(gè)青魚群體的個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序,將得到的序列結(jié)果進(jìn)行校正、拼接、刪除兩端多余的序列后得到的COⅠ基因長(zhǎng)度為1003 bp。4 種堿基在9 個(gè)群體的分布基本一致,A、C、G和T的平均含量分別為26.34%、27.26%、19.00%和27.39%,A+T含量(53.73%)高于G+C(46.27%)含量。COⅠ基因序列包含6個(gè)變異位點(diǎn),全部為轉(zhuǎn)換位點(diǎn),且以A/G之間的轉(zhuǎn)換為主。

2.2 遺傳多樣性分析

江蘇邗江群體的單倍型最多,有7種單倍型,湖北石首、湖南湘江群體有5種單倍型,廣西西埌群體、江西瑞昌群體和江蘇吳江群體有4種單倍型,陜西西安群體和廣東佛山群體有3種單倍型。9個(gè)群體的單倍型多樣性為0.403—0.847,江蘇邗江群體的單倍型多樣性最高,為0.847(Hd＞0.800),除廣東佛山外其他青魚群體單倍型多樣性也較高(0.500＜Hd＜0.800),而廣東佛山群體遺傳多樣性最低,為0.403。9 個(gè)群體的核苷酸多樣性為0.00109—0.00244,青魚群體整體核苷酸多樣性較低,江蘇邗江群體的核苷酸多樣性最高 (π=0.00244),而廣東佛山的核苷酸多樣性最低(π=0.00109)。江蘇邗江群體中的平均核苷酸差異數(shù)最多為 1.86207,廣東佛山群體最少為0.83131(表2)。

表2 青魚群體COⅠ基因遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity parameters of COⅠ gene in M.piceus population

2.3 青魚群體遺傳分化及系統(tǒng)發(fā)育

基于Kimura2-paramester模型計(jì)算了9個(gè)青魚群體的種內(nèi)和種間遺傳距離(表3)。佛山群體與西安群體、吳江群體,西安群體與吳江群體間的遺傳距離最小為0.001,其余群體間遺傳距離相同,且大多集中在0.002。西埌與湘江、邗江群體,瑞昌與湘江群體間的遺傳距離最大為0.003,在本實(shí)驗(yàn)中,青魚各群體間的遺傳距離在0.001—0.003,遠(yuǎn)未達(dá)到亞種的分化標(biāo)準(zhǔn)[7]。

表3 基于COⅠ基因序列的青魚群體間的遺傳距離Tab.3 Genetic distance between populations of M.piceus based on COⅠ gene sequence

計(jì)算了COⅠ基因的群體間Fst指數(shù),并且計(jì)算了群體間的基因流Nm(表4)。結(jié)果顯示:9個(gè)群體間的Fst遺傳分化系數(shù)1為-0.0033—0.23445,基因流Nm為0.51604—1.13224,9個(gè)青魚群體間存在一定的遺傳分化,也存在一定的基因交流[13]。

表4 青魚9個(gè)群體間COⅠ遺傳分化和基因流Tab.4 Pair wise Fst of COⅠ between 9 M.piceus populations

NJ進(jìn)化樹顯示(圖1),江蘇邗江群體與湖南湘江群體聚成一個(gè)分支,再與浙江嘉興群體聚成一支,廣東佛山、陜西西安、江蘇吳江聚為一支,廣西西埌與江西瑞昌聚為一支,再與湖北石首聚為一支,兩支姐妹分支聚集在一起,最終與浙江嘉興,湖南湘江,江蘇邗江群體聚在一起。

圖1 基于COⅠ基因序列構(gòu)建的青魚9個(gè)群體NJ進(jìn)化樹Fig.1 NJ evolutionary trees of nine M.piceus populations of M.piceus based on COⅠ gene

在9個(gè)青魚群體間COⅠ序列的分子變異(AMOVA)結(jié)果中(表5),青魚群體間遺傳變異占比為9.67%,群體內(nèi)遺傳變異占比為90.33%,9個(gè)青魚群體的遺傳變異主要來源于群體內(nèi)。

表5 青魚群體間 COⅠ 基因的 AMOVA 分析Tab.5 AMOVA analysis of COⅠ gene in populations of M.piceus

2.4 單倍型分析

271尾青魚COⅠ序列共檢測(cè)到7個(gè)單倍型,編號(hào)為Hap1—Hap7,其中Hap4在9個(gè)群體中都有分布,其次是Hap1和Hap3在8個(gè)群體中有分布,Hap2在7個(gè)群體中有分布,Hap5在3個(gè)群體中有分布,Hap6、Hap7在兩個(gè)群體中有分布,沒有發(fā)現(xiàn)獨(dú)享單倍型(表6)。圖 2展示的是使用基于Median-joining法構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖,網(wǎng)絡(luò)的中間位置一般是古老的單倍型,其余單倍型可以通過單一突變和多步突變相連接,在古老單倍型周圍呈現(xiàn)出星狀分布[10],單倍型Hap4在9個(gè)群體中都有分布,并且處于單倍型網(wǎng)絡(luò)的中央,因此可能是較為原始的單倍型,由單倍型網(wǎng)絡(luò)圖以及單倍型在各個(gè)群體中的分布可知,單倍型的地理分布與青魚群體的地理位置分布沒有明顯的相關(guān)性。

表6 七種單倍型在青魚9個(gè)群體中的分布Tab.6 7 Haplotypes distribution of COⅠ gene in 9 M.piceus populations

圖2 九個(gè)群體青魚COⅠ基因單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The haplotype network of M.piceus based on COⅠ gene in 9 populations

3 討論

對(duì)青魚群體的遺傳多樣性進(jìn)行研究是保護(hù)青魚種質(zhì)資源的前提條件,具有較高的遺傳多樣性的種群的生存概率越高。目前,COⅠ基因已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到了水產(chǎn)動(dòng)物的群體遺傳研究中[14—16]。

3.1 青魚的遺傳多樣性

對(duì)9個(gè)青魚地理群體共271個(gè)個(gè)體線粒體COⅠ基因區(qū)段的遺傳多樣和單倍型進(jìn)行了研究。青魚群體的總體單倍型多樣性較高,但是核苷酸多樣性較低,與謝啟明等[4]利用線粒體Cytb基因分析得出的結(jié)果相近。就遺傳多樣性而言,湘江群體高于瑞昌群體,與方耀林等[17]得到的結(jié)果一致。付曉燕等[3]通過對(duì)青魚線粒體Cytb基因的分析,發(fā)現(xiàn)珠江水系廣東云浮的遺傳多樣性比長(zhǎng)江水系的青魚遺傳多樣性要低。本研究中來自良種場(chǎng)的養(yǎng)殖群體廣東佛山青魚單倍型多樣性和核苷酸多樣性都比其他青魚群體低,也說明了廣東地區(qū)青魚的遺傳多樣性可能偏低。來自良種場(chǎng)的養(yǎng)殖群體江蘇吳江群體遺傳多樣性低于其他野生群體,與Zhou等[18]發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相一致,此外,這也與王沈同等[19]分析結(jié)果一致。

與單倍型多樣性相比,核苷酸多樣性的累計(jì)時(shí)間要更長(zhǎng),在一定程度上更能反映群體的遺傳多樣性,本研究中除了廣東佛山群體表現(xiàn)出低Hd低π型,其余群體均表現(xiàn)出高Hd低π型(Hd＞0.05,π＜0.005)型,根據(jù)Grand等[20]的理論,我們推測(cè)表現(xiàn)出廣東佛山群體可能經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng),而高Hd低π型的8個(gè)群體經(jīng)歷過快速的種群擴(kuò)張事件。由于某些原因,在短時(shí)間內(nèi),8個(gè)種群的數(shù)量急劇增加,從而導(dǎo)致單倍型多樣性的急劇增加,但是核苷酸的變異速度要慢得多,沒有足夠充足的時(shí)間來積累核苷酸變異,因此表現(xiàn)出高Hd低π型。

3.2 青魚的群體遺傳分化

群體間的遺傳分化程度可以用遺傳分化指數(shù)來表示[21],通常認(rèn)為Fst＜0.05為低度遺傳分化;當(dāng)0.05＜Fst＜0.15時(shí)為中度的遺傳分化;當(dāng)0.15＜Fst＜0.25時(shí)為高度的遺傳分化,當(dāng)Fst＞0.25時(shí)遺傳分化極大。在本研究中,9個(gè)群體間的Fst值在-0.0033—0.23445,群體間的遺傳分化在低度至高度之間,主要存在于低度和中度分化水平。推測(cè)由于青魚的洄游性,每年洄游至產(chǎn)卵場(chǎng)產(chǎn)卵的繁殖行為,使得各個(gè)群體之間產(chǎn)生了一定的基因交流,從而削弱了環(huán)境對(duì)群體分化的影響,使得野生群體之間分化不明顯。

在通常情況下,基因交流的概率會(huì)隨著地理距離的加大而減小,也更容易出現(xiàn)遺傳分化。但是也有研究發(fā)現(xiàn)由于環(huán)境的作用,遺傳距離與地理距離也會(huì)存在沒有明顯相關(guān)性。朱曉東等[22]發(fā)現(xiàn)鰱群體間的遺傳距離與地理距離的遠(yuǎn)近沒有明顯的相關(guān)性,劉紅艷等[23]研究發(fā)現(xiàn)黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)群體間遺傳距離與地理距離也無明顯相關(guān)性。王豐等[6]使用微衛(wèi)星分析了青魚的遺傳結(jié)構(gòu),其結(jié)果顯示,江蘇吳江群體與江蘇邗江、浙江嘉興群體的遺傳距離較近,但是其遺傳距離反而較遠(yuǎn),推測(cè)可能是由于太湖擁有大面積的湖泊環(huán)境,而其他4個(gè)群體不存在類似的水文條件。本研究發(fā)現(xiàn)廣西西埌群體和江西瑞昌、浙江嘉興群體地理距離較遠(yuǎn),但遺傳距離較近,廣東佛山群體和江蘇吳江群體也是如此。相反廣西西埌群體和廣東佛山群體的地理距離較近,遺傳距離卻較遠(yuǎn)。系統(tǒng)發(fā)育樹同時(shí)也證實(shí)了這種情況,而在單倍型的統(tǒng)計(jì)中也發(fā)現(xiàn),單倍型的分布與青魚群體的地理位置分布沒有明顯的相關(guān)性,可能與其特殊的水域環(huán)境或來源有關(guān)。

本研究通過分析9個(gè)青魚群體的遺傳變異,發(fā)現(xiàn)9個(gè)群體的遺傳多樣性總體較低,遺傳分化程度在低度至高度之間,主要表現(xiàn)在低度和中度分化,群體之間有著一定的基因交流,為青魚種質(zhì)資源的保護(hù)和開發(fā)提供了重要的理論依據(jù)。