魯媛晨 李艷華 余麗華 韓丹翔 馬海燕

(1.中國科學(xué)院水生生物研究所,武漢 430072;2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049;3.北京大學(xué)工學(xué)院藻類生物技術(shù)創(chuàng)新實驗室,北京 100871)

1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(1,3-Dioleoyl-2-palmitoylglycerol,OPO)是母乳脂肪中含量最豐富的甘油三酯(Triacylglycerol,TAG)[1]。大量研究證明,TAG的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)即脂肪酸在甘油骨架上的分布會影響其吸收代謝[2,3]。人乳中這種獨特的sn-2位為棕櫚酸(C16∶0),sn-1/3位為油酸(C18∶1)的甘油三酯在嬰兒的成長期間起著重要的作用,可以促進脂肪酸和鈣質(zhì)的有效吸收,保證嬰兒的能量攝入,并且可以改善嬰兒便秘,增加嬰兒骨骼強度[4—7]。2008年,中華人民共和國衛(wèi)生部公告批準OPO可以作為營養(yǎng)強化劑應(yīng)用于嬰兒配方奶粉中[8],預(yù)計未來我國嬰幼兒奶粉市場對OPO純品的年需求量可達3.6—13×107kg。

然而,目前國內(nèi)市面上的商業(yè)化OPO大多依賴進口,并且是由一步酸解反應(yīng)或兩步醇解酯化反應(yīng)酶法合成的[9]。酶催化的過程提高了工藝的成本和復(fù)雜性,價格與質(zhì)量之間的矛盾限制了OPO的應(yīng)用程度[10]。因此亟待開發(fā)出可以規(guī)?；a(chǎn)的天然OPO產(chǎn)品,如尋找新的富含OPO的油脂來源以滿足市場需求,同時解決依賴進口的問題。

萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是研究脂質(zhì)代謝的模式生物,在環(huán)境脅迫的條件下可以積累大量的TAG作為儲存脂質(zhì)[11]。分析發(fā)現(xiàn)其總脂肪酸組成絕大部分為C16和C18脂肪酸[12]。此前,有研究者發(fā)現(xiàn),在缺氮脅迫條件下萊茵衣藻細胞中90%以上的TAGsn-2位是C16脂肪酸,且60%以上為C16∶0,而sn-1/3位上C16∶0和C18∶1的占比也接近30%[13]。在萊茵衣藻中存在兩條TAG從頭合成的肯尼迪途徑,分別定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)體,其中溶血性磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(Lysophosphatidic acid Acyltransferase,LPAAT)是負責(zé)TAG中sn-2位?；拿浮．?dāng)在萊茵衣藻中過表達萊茵衣藻質(zhì)體定位的CrLPAAT1時,sn-2棕櫚酸酯的含量明顯提高[14];而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的CrLPAAT2也更加偏好C16∶0-CoA作為供體[15]。以上研究暗示萊茵衣藻中可能存在天然合成OPO的通路。

由于細胞內(nèi)甘油三酯的組成非常復(fù)雜,針對特定結(jié)構(gòu)TAG的檢測一直是研究的難點,目前國內(nèi)還未出臺有關(guān)OPO的標準檢測方法?，F(xiàn)有的針對OPO的檢測方法主要通過氣相色譜、高效液相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等。其中氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法無法將OPO和它的同分異構(gòu)體OOP完全分開[16,17]。銀離子色譜柱液相色譜法雖然可以使TAG同分異構(gòu)體受到不同的束縛力分離開,但穩(wěn)定性差,柱子使用壽命短[18]。而液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用具有更高的靈敏度和精確度,且不需對樣品進行前處理,在特定TAG分析上更具優(yōu)勢。超高效液相色譜(Ultra-High Performance Liquid Chromatography,UPLC)可以極大地提高色譜分離能力并縮短分析時間;質(zhì)譜(Mass Spectrometer,MS)僅利用特征碎片離子就可以進行分子結(jié)構(gòu)分析,其中三重四級桿分析器(Triple Quadrupole System,TQS)是進行單一m/z掃描最靈敏的儀器[19];電噴霧電離(ESI)離子源在脂質(zhì)分析中早有應(yīng)用,技術(shù)成熟。UPLC與MS聯(lián)用儀可以對藻油樣品中的OPO進行高效分析。

本研究首先建立了基于超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)的OPO分析方法,并對缺氮脅迫條件下一株野生型萊茵衣藻cc-5325及其半乳糖基水解酶基因敲降突變體M08的OPO進行了定量分析,為進一步研究萊茵衣藻中OPO的生物合成提供了技術(shù)支持,也為產(chǎn)業(yè)化OPO生產(chǎn)提供了思路和方向。

1 材料與方法

1.1 萊茵衣藻藻種與培養(yǎng)方法

萊茵衣藻C.reinhardtiicc-5325(cw15mt+)和萊茵衣藻半乳糖基水解酶(Galactosyl Hydrolase,CrGH)基因插入突變株LMJ.RY0402.088610均購自美國明尼蘇達大學(xué)衣藻資源中心(ChlamydomonasResource Center,https://www.chlamycollection.org/)。為方便描述,上述藻株分別簡稱為cc-5325和M08。Crgh基因插入突變株M08的外源基因插入位點位于該基因內(nèi)含子,且在缺氮條件下,CrGH蛋白表達水平顯著降低[20]。

從TAP固體平板上挑取單藻落接種于20 mL新鮮TAP液體培養(yǎng)基中,在光照強度40 μmol/(m2·s)、溫度25℃和轉(zhuǎn)速140 r/min下培養(yǎng)至對數(shù)生長期。以起始濃度2.0×105cells/mL轉(zhuǎn)接至200 mL TAP液體培養(yǎng)基培養(yǎng),3d后更換為缺氮培養(yǎng)條件。以1000×g離心力離心藻液5min收集藻細胞,用缺氮TAP培養(yǎng)基清洗藻泥1次,重復(fù)離心后重懸藻泥至對應(yīng)體積的缺氮TAP培養(yǎng)基中,在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)3d。從更換缺氮培養(yǎng)基開始,每天取樣進行細胞計數(shù)、干重測量、定量PCR檢測及OPO含量分析。本實驗設(shè)置3個生物學(xué)平行。

1.2 生長曲線和生物質(zhì)測定

每天固定時刻取藻液1 mL,添加魯哥氏碘液(終濃度1%)固定藻細胞。使用血球計數(shù)板在普通光學(xué)顯微鏡下計數(shù),計算藻細胞密度。每份樣品計數(shù)4—6次并計算平均值。

藻細胞的干重測定參考Yin等[21]的105℃恒重法。在測定細胞干重前,將玻璃微纖維濾膜(Whatman GF/C膜)編號,于105℃過夜烘干,置于真空干燥容器中冷卻,稱量記錄膜重M1。每天固定時刻取藻液V=10 mL,使用GF/C膜抽濾去除培養(yǎng)基并用1 mol/L碳酸氫銨溶液清洗藻細胞1次。抽濾后的GF/C 膜移至105℃過夜干燥,次日置于真空干燥容器中冷卻,稱量帶有烘干藻細胞的濾膜并記錄總重M2,計算藻細胞生物量DW(g/mL)=(M2-M1)/V。

1.3 實驗試劑和標準品

三氯甲烷(色譜級)、乙酸銨(質(zhì)譜級)和甲酸(質(zhì)譜級)購自美國Sigma-Aldrich公司;甲醇(質(zhì)譜級)、乙腈(質(zhì)譜級)和異丙醇(質(zhì)譜級)購自德國Merck公司。色譜級試劑用于總脂提取,質(zhì)譜級試劑用于液質(zhì)聯(lián)用儀分析。

外標標準品OPO和內(nèi)標標準品十七烷酸甘油三酯(C17:0/C17:0/C17:0)標準品均購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.4 萊茵衣藻Crgh基因轉(zhuǎn)錄水平檢測

RNA提取方法參照TransZolUp Plus RNA Kit試劑盒(ER501-01,TransGen Biotech)說明書。cDNA合成參照TransScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒(AT341-01,TransGen Biotech)說明書。

采用相對定量法檢測Crgh基因的轉(zhuǎn)錄水平,內(nèi)參基因選擇α-Tubulin。熒光定量使用的Crgh引物和內(nèi)參基因引物為:Crgh-F 5′-ACTGGTGGGG CATCAACTACTAC-3′/Crgh-R 5′-GTCTCAGTGA TGTACATGGGAATG-3′;α-Tubulin-F 5′-CTCGCT TCGCTTTGACGGTG-3′/α-Tubulin-R 5′-CGTGG TACGCCTTCTCGGC-3′。

qPCR擴增體系包括5 μL 2 × ChamQ Univeral SYBR qPCR Green Master Mix(Q711,Vazyme),10 μmol/L引物各0.2 μL,100 ng稀釋后的cDNA模板,加入ddH2O至反應(yīng)體系為10 μL。qPCR反應(yīng)條件為:95℃,600s;95℃,15s;60℃,30s;72℃,30s;40 cycles;95℃,60s;40℃,60s;65℃,1s;97℃,1s;37℃,30s。

1.5 總脂提取

總脂提取參考Yoon等[22]和Guo等[23]的方法并在此基礎(chǔ)上改進,在收獲的藻泥中加入4 mL甲醇∶氯仿∶甲酸(20∶10∶1,v/v/v),室溫下劇烈振蕩1h;加入2 mL的0.2 mol/L H3PO4與1 mol/L KCl混合溶液,室溫下劇烈振蕩5min;1000×g離心力離心10min后,用巴斯德玻璃吸管吸取下層有機層轉(zhuǎn)移至新的玻璃樣品瓶中;另外吸取1 mL氯仿加至提取管中,重復(fù)前兩步操作萃取出殘留的油脂;氮氣吹除有機溶劑,藻油凍存于-20℃。

1.6 標準溶液配制和標準曲線建立

將OPO標準品和C17∶0甘油三酯標準品分別用氯仿溶解,配制成終濃度為2 mg/mL的OPO標準溶液和20 μg/mL的C17∶0甘油三酯標準溶液,保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

定量吸取2 mg/mL的OPO標準溶液,用氯仿:甲醇(1∶1,v/v)溶液稀釋成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的OPO溶液,然后由高至低逐級稀釋得到質(zhì)量濃度梯度為250、125、62.5、31.25、15.625和7.8125 μg/mL的OPO系列標準工作液。每個濃度梯度的OPO標準工作液取195 μL并各加入5 μL 20 μg/mL的C17∶0甘油三酯,使內(nèi)標質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL。繪制OPO峰面積/內(nèi)標物峰面積——OPO濃度/內(nèi)標物濃度的曲線,計算內(nèi)標標準曲線方程及相關(guān)系數(shù)。

1.7 藻油樣品前處理

將提取的藻油復(fù)溶于氯仿∶甲醇(1∶1,v/v)溶液中,每10 mg 藻生物質(zhì)對應(yīng)1 mL 氯仿:甲醇溶液;經(jīng)孔徑0.22 μm的有機相針式過濾器濾過濾;取195 μL藻油濾液,加入5 μL 20 μg/mL的C17∶0內(nèi)標溶液,充分振蕩混勻后進行UPLC-MS/MS分析。

1.8 UPLC-MS/MS法定量分析OPO

儀器采用ACQUITY超高效液相色譜儀(美國Waters公司)串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜(美國Waters公司)。向1 μg/mL的OPO標準溶液加入10 mmol/L乙酸銨,以10 μL/min流速直接進樣于質(zhì)譜的ESI源,在正離子模式下,對OPO的母離子[M+NH4]+(m/z 876.80)進行子離子掃描。高純氮氣作為霧化和干燥氣體,流速為600 L/h,去溶劑溫度為300℃。毛細管電壓和錐孔電壓分別為3000和40 V,碰撞能量20 V。

色譜條件參考Li等[24]的方法并在此基礎(chǔ)上改進。色譜分離采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm,美國Waters公司);柱溫35℃;進樣量為1 μL;流速為0.2 mL/min;流動相:A相為甲醇∶乙腈∶水(19∶19∶2,v/v/v),B相為異丙醇,兩者皆含有0.1%的甲酸和10 mmol/L的乙酸銨。梯度洗脫程序見表 1。

表1 UPLC梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution conditions of UPLC

質(zhì)譜檢測的離子源為電噴霧離子源(Electrospray Ionization,ESI),在正離子模式下,采用多反應(yīng)監(jiān)測(Multiple Reaction Monitoring,MRM)模式,以高純氮氣作為霧化和干燥氣體,流速為800 L/h,去溶劑溫度為450℃。毛細管電壓和錐孔電壓分別為3000和40 V,碰撞能量20 V。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用MassLynx V 4.1軟件(Waters)進行數(shù)據(jù)采集和分析,采用Microsoft Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理和圖表制作,實驗結(jié)果以算術(shù)平均值±平均絕對偏差表示,采用Student’st-test對組間數(shù)據(jù)進行比較,P＜0.05時,認為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 建立基于UPLC-MS/MS的OPO分析方法

在正離子模式下,對OPO標品溶液直接進樣進行全掃描,得到其準分子離子為[M+NH4]+,即母離子質(zhì)荷比m/z為876。對[M+NH4]+(m/z 876)進行子離子掃描,如圖 1所示,碎片離子m/z 577.24 [M+NH4-299]+和m/z 603.28 [M+NH4-273]+分別為中性丟失299(C18H34O2+NH3)和中性丟失273(C16H32O2+NH3)的碎片,根據(jù)質(zhì)荷比推算所丟失的碎片分別是sn-1或sn-3位上的油酸?；蛃n-2位上的棕櫚酸酰基相關(guān)碎片。碎片離子m/z 313.18 [R2CO+74]+和m/z 339.08 [RxCO+74]+(X=1,3)分別為丟失了sn-1,3位酰基和sn-1,2或sn-2,3位?；乃槠Ｋ槠x子m/z 264.99 [R2CO]+(X=1,3)和m/z 239.02 [R2CO]+分別為油酸酰基和棕櫚酸?；嚓P(guān)碎片。

圖1 OPO子離子掃描質(zhì)譜圖Fig.1 The product-ion scanning spectrum of the [M+NH4]+ ion of OPO

根據(jù)OPO的子離子掃描圖譜,本研究選擇了其中相對豐度最高的子離子m/z 577.24及其母離子m/z 876.44作為OPO的MRM定量離子對。考慮到色譜的分離效率和樣品中離子化效率,流動相中添加0.1%的甲酸和10 mmol/L的乙酸銨以獲得理想的分離度、保留時間和峰型。在優(yōu)化的質(zhì)譜和色譜條件下,以MRM模式檢測OPO標品的總離子流色譜圖如圖 2所示,保留時間為21.25min,保留時間窗口為0.6min。

圖2 OPO總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of OPO

2.2 OPO標準曲線方程

根據(jù)已知濃度的OPO標品溶液建立標準曲線。對1.5中的系列梯度標準溶液進行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定,以O(shè)PO的濃度/內(nèi)標物濃度為橫坐標(X,μg/mL),標準品OPO與內(nèi)標C17:0的峰面積之比為縱坐標(Y),進行線性回歸分析,得到OPO的標準曲線方程為:Y=0.0083X＋0.2248(相關(guān)系數(shù)R2=0.991),如圖 3所示,結(jié)果顯示OPO在7—250 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2大于0.99,表明該方法有較高的靈敏度和準確度,因此可采用此方法對樣品中的OPO進行定量分析。

圖3 OPO的標準曲線方程Fig.3 Standard curves of OPO

2.3 萊茵衣藻cc-5325中OPO的檢測

通過上述研究建立的UPLC-MS/MS法對缺氮脅迫條件下的萊茵衣藻cc-5325細胞總脂粗提物中的OPO進行檢測,根據(jù)提取離子流圖中OPO峰強度可以判斷cc-5325在缺氮條件下的OPO積累情況(圖4)。結(jié)果顯示,在正常培養(yǎng)條件下(N0),細胞內(nèi)僅積累極少量的OPO(圖4A),而在缺氮脅迫下(N1-N3)可以檢測到OPO的特征離子峰,且峰強度遠高于正常培養(yǎng)條件下OPO的峰強度,表明萊茵衣藻中的OPO在缺氮時大量積累。

圖4 MRM檢測模式下特征離子掃描鑒定OPOFig.4 Identification of OPO by characteristic ion scanning detected by MRM

2.4 萊茵衣藻野生型和Crgh突變株的性狀表征

圖5為遺傳背景不同的萊茵衣藻野生型cc-5325和Crgh插入突變株M08的生長、生物質(zhì)積累及Crgh基因表達性狀表征。在正常培養(yǎng)條件下,M08的Crgh基因轉(zhuǎn)錄水平相較于野生型下調(diào)了85.6%,說明插入突變對M08的Crgh基因表達造成了影響(圖5A),以上結(jié)果表明,突變株M08的Crgh基因在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。

在缺氮脅迫條件下,萊茵衣藻細胞內(nèi)會積累大量TAG。圖 5B和5C為野生型cc-5325和Crgh插入突變株M08在缺氮培養(yǎng)條件下的生長情況,結(jié)果顯示,兩者的生物量在缺氮培養(yǎng)期間持續(xù)積累,在缺氮第3天時達到最高,分別為0.60和0.38 mg/mL;兩者的細胞密度在缺氮期間不再大幅變化,在缺氮第3天時分別保持在0.85和1.41×105cells/mL左右。整體來看,插入突變株M08的生物量在整個培養(yǎng)期間都低于cc-5325,而細胞密度卻高于cc-5325,即cc-5325具有更高的單細胞干重。

圖5 萊茵衣藻野生型cc-5325和Crgh突變株M08的性狀表征Fig.5 Characterization of wild-type cc-5325 and Crgh mutant strain M08

2.5 萊茵衣藻野生型和Crgh突變株的OPO含量表征

通過前述研究建立的UPLC-MS/MS方法對cc-5325和M08缺氮條件下的OPO含量進行定量分析。結(jié)果如圖 6所示,在缺氮脅迫第1至第3天,野生型cc-5325的OPO含量分別為0.82%、1.05%和0.96%,突變株M08的OPO含量分別為3.84%、4.22%和3.59%,兩者的OPO含量變化呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,都在缺氮第2天達到了最高。M08的OPO含量始終高于野生型cc-5325,且在缺氮的第2和第3天達到了顯著(P＜0.05),相較于野生型cc-5325分別提高了3.70、3.04和2.74倍。在缺氮脅迫第1至第3天,cc-5325的OPO產(chǎn)量分別達到了3.76、5.25和5.90 μg/mL,M08的OPO產(chǎn)量分別達到了8.01、13.26和13.73 μg/mL,兩者的OPO產(chǎn)量都在缺氮第3天時達到了最高。插入突變株M08的OPO產(chǎn)量也在整個缺氮脅迫期間顯著高于野生型cc-5325(P＜0.05),相較于cc-5325分別提高了1.13、1.53和1.33倍。

圖6 缺氮培養(yǎng)時萊茵衣藻野生型cc-5325和Crgh突變株M08的OPO積累(*P＜0.05)Fig.6 The accumulation of OPO in wild-type cc-5325 and Crgh mutant strain M08 under nitrogen deprivation (*P＜0.05)

3 討論

3.1 UPLC-MS/MS法定量定性O(shè)PO

本文通過優(yōu)化高效液相色譜以及質(zhì)譜條件,建立了適用于分析藻油中OPO含量的UPLC-MS/MS定量定性方法。結(jié)果表明,該方法可以有效地鑒定和定量分析細胞中的OPO,同時該方法也將適用于分析其他特定?；M成的TAG。TAG是一種中性脂質(zhì),一般的電離技術(shù)很難讓TAG帶電荷,本研究采用的ESI離子源可以使TAG分子在離子對試劑的輔助下進行很好的電離[25],目前較常用的離子對試劑是金屬鋰化合物或鈉鹽,形成母離子加合物[M +Li]+或者[M+Na]+,但是金屬離子會污染質(zhì)譜系統(tǒng)從而導(dǎo)致檢測器靈敏度降低。因此在本研究中,選擇了較理想的對質(zhì)譜友好且易揮發(fā)的乙酸銨作為離子對試劑,形成母離子加合物[M+NH4]+,同時添加0.1%的甲酸改善分離度、保留時間和峰型。在子離子模式中,母離子[M+NH4]+經(jīng)過碰撞可分解產(chǎn)生[M+NH4-RCOONH4]+(DAG+)和[RCO]+特征碎片離子,[M+NH4]+、DAG+和[RCO]+的信號對于TAG分子的定性和定量十分重要[26]。本文中所建立的方法正是基于此原理,在電子碰撞作用下,TAG會產(chǎn)生三種脂肪酸?；槠腿NDAG+特征碎片,分別為[R1CO]+、[R2CO]+、[R3CO]+和sn-1,2-DAG+、sn-2,3-DAG+、sn-1,3-DAG+,由于OPO的sn-1/3位上具有相同的脂肪酸組成,所以O(shè)PO會產(chǎn)生兩種脂肪酸酰基碎片和兩種DAG+特征碎片。甘油骨架上斷裂一個sn-2位脂肪酸所需要的能量要高于斷裂一個sn-1/3位的脂肪酸,因此sn-1,2-DAG+和sn-2,3-DAG+的比例要大于sn-1,3-DAG+,而sn-2脂肪酸所對應(yīng)的[R2CO]+碎片離子的豐度值更低,通過這種方式可以判斷TAG上脂肪酸鏈的組成和位置,從而完成TAG的定性[27]。UPLC-MS/MS方法不需要對樣品進行衍生處理,具有重復(fù)性好,檢測方便快捷,精度高等優(yōu)點。

本研究建立的方法對OPO標品進行了定性并建立了OPO的定量標準曲線(圖1— 3),結(jié)果顯示在5—250 μg/mL濃度范圍內(nèi)OPO線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)可以達到0.99以上,表明本方法能夠準確地對樣品中的OPO含量進行定量。利用該方法對萊茵衣藻野生型cc-5325中提取的藻油進行了分析,發(fā)現(xiàn)總離子流圖的特征離子峰保留時間十分穩(wěn)定(圖4),表明本研究方法的重現(xiàn)性較好、穩(wěn)定性和可靠性高。缺氮條件下的萊茵衣藻細胞中可以檢測到天然OPO,外標法定量分析發(fā)現(xiàn)其含量可以達到干重的1.05%,這證實了萊茵衣藻作為OPO合成細胞工廠的應(yīng)用潛力和商業(yè)化價值。該方法可以應(yīng)用于研究不同遺傳改造的萊茵衣藻OPO合成情況的動態(tài)變化,從而為進一步開發(fā)OPO新油脂來源提供方向。

3.2 不同遺傳背景萊茵衣藻細胞內(nèi)的OPO變化

萊茵衣藻在脅迫的環(huán)境條件下會積累大量的TAG,這個過程伴隨著光合膜脂(類囊體膜和葉綠體膜上的脂質(zhì))的降解[11]。不同遺傳背景的萊茵衣藻在生長速率、碳流分配等方面存在著差異,TAG合成通路及其關(guān)聯(lián)代謝途徑的基因的突變極有可能影響OPO的含量。本研究選擇了萊茵衣藻野生型cc-5325和Crgh缺陷突變株M08定量分析其細胞內(nèi)的OPO合成情況,發(fā)現(xiàn)在由正常培養(yǎng)轉(zhuǎn)換為缺氮培養(yǎng)的過程中,兩株藻株的OPO含量都在初始階段急劇增加,隨后基本穩(wěn)定,OPO產(chǎn)量在此過程中持續(xù)積累,而M08的OPO積累在缺氮條件下遠高于野生型cc-5325。研究發(fā)現(xiàn),在脅迫條件下,萊茵衣藻Crgh基因表達和蛋白水平均有上調(diào),半乳糖基水解酶介導(dǎo)了光合膜脂向TAG的轉(zhuǎn)化,由于Crgh的插入突變,M08的TAG積累會低于其野生型cc-5325[20]。而本研究發(fā)現(xiàn)M08的OPO含量和產(chǎn)量均較其野生型cc-5325有顯著提高,表明萊茵衣藻中OPO與總TAG的積累不是簡單地正相關(guān),其背后還有一些復(fù)雜的未知機制。Crgh在高等植物如擬南芥中的同源基因AtSFR2可以利用糖脂合成二脂?；视?Diacylglycerol,DAG)[28],DAG是肯尼迪途徑中合成TAG的前體產(chǎn)物。故推測Crgh在萊茵衣藻中也行使相同的功能,M08突變株中該基因的缺陷可能會導(dǎo)致缺氮條件下質(zhì)體肯尼迪途徑TAG合成的降低。OPO含量的升高可能是因為其合成主要由位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的真核肯尼迪途徑貢獻。但該假說還需要進一步實驗驗證。

通過遺傳改造萊茵衣藻油脂代謝途徑的某些相關(guān)基因,如Crgh,的確會對萊茵衣藻細胞內(nèi)sn-2棕櫚酸酯如OPO的合成造成影響。此前,有研究者利用代謝工程手段對擬南芥(Arabidopsis thaliana)種子的油脂代謝途徑進行遺傳操作,在種子中過表達偏好C16∶0-CoA的歐洲油菜(Brassica napus)Bnlpaat1基因,隨后敲降了擬南芥真核途徑的原生Atlpaat2基因,并敲除了會使磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)和甘油二酯(Diacylglycerol,DAG)互變的磷脂酰膽堿:二?；视湍憠A磷酸轉(zhuǎn)移酶(PC:DAG cholinephosphotransferase,PDCT)Atpdct基因,最終使得TAG中sn-2棕櫚酸酯含量提高了20多倍[29],這說明利用功能已知的靶基因去理性改造油脂代謝途徑可以實現(xiàn)特定立體化學(xué)結(jié)構(gòu)的TAG(sn-2棕櫚酸酯)的大量積累,使其具有成為細胞工廠的潛力。萊茵衣藻質(zhì)體來源的CrLPAAT1及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的CrLPAAT2對棕櫚酸的底物偏好性使得其作為OPO細胞工廠的優(yōu)勢更加突出[14,15]。

本研究為定量分析微藻中特定結(jié)構(gòu)的TAG提供了一種高效、準確和便捷的技術(shù)手段,并證實了萊茵衣藻作為OPO細胞工廠的可行性。作為一種安全級微生物,萊茵衣藻基底盤細胞的發(fā)展空間巨大,在脅迫條件下如何精準地調(diào)控微藻細胞內(nèi)的碳流,將固碳網(wǎng)絡(luò)向目的產(chǎn)物的方向延伸,加強萊茵衣藻中OPO的積累是未來重點研究的方向。脂質(zhì)合成途徑的關(guān)鍵酶基因作為潛在靶點,對其的進一步研究將幫助加速構(gòu)建萊茵衣藻綠色生物制造平臺。