王 芳，包怡紅，蘭慧娟

1 北大荒完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司質(zhì)檢中心，黑龍江哈爾濱 150078

2 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150000

0 引言

維生素D3也叫脂溶性維生素，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化和人體免疫功能，有利于新骨發(fā)育和鈣化，可促進骨骼生長，預(yù)防骨質(zhì)疏松癥[1～3]。對于嬰幼兒的生長發(fā)育，維生素D3是必不可少的營養(yǎng)元素，也是嬰幼兒配方奶粉（簡稱“嬰配粉”）中必須要添加的營養(yǎng)物質(zhì)。其在受溫度及光作用下會變得不穩(wěn)定易分解，因此研究在不同貯藏條件下維生素D3的穩(wěn)定性非常必要[4～8]。本文采用《GB 5009.82—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素A，D，E的測定》第四法食品中維生素D的測定——高效液相色譜法比較3 種嬰配粉中脂溶性維生素D3在不同溫度的貯藏過程中的含量變化情況，以優(yōu)化貯藏條件，減少對脂溶性維生素D3含量的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

高效液相色譜儀（紫外檢測器），美國Perkin Elmer股份有限公司；分析天平（感量0.1 mg），梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；水浴磁力恒溫攪拌器，常州華奧儀器制造有限公司；萃取凈化振蕩器、氮吹儀，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、渦旋混合器，德國IKA集團。

1.1.2 試劑

氫氧化鉀溶液；稱取500 g氫氧化鉀，加入400 mL水溶解，冷卻后，儲存于聚乙烯瓶中；半制備維生素D流動相：環(huán)己烷∶正己烷（1∶1）并按體積分?jǐn)?shù)0.8%加入異丙醇；流動相：甲醇（色譜純）。

維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品：購買經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）配制維生素D3儲備液（1 000 μg/mL）和維生素D3工作液，濃度分別為0.06 μg/mL、0.12 μg/mL、0.24 μg/mL、0.36 μg/mL、0.48 μg/mL、0.60μg/mL。

1.2 試驗步驟

1.2.1 試驗方法

隨機選取超市中3 種不同品牌的幼配粉（12～36 個月），每個品牌4 個樣品，在陰涼干燥處（0~4 ℃）、常溫（18~20 ℃）、低溫（-18 ℃）及高溫（30 ℃）4 種貯藏條件下，分別儲存4 周，每周測定1 次維生素D3含量變化。

1.2.2 樣品處理

（1）皂化

稱取5 g（精確至0.01g）經(jīng)均質(zhì)處理的試樣于150 mL平底燒瓶中，試樣需加入約20 mL溫水，混勻，再加入1.0 g抗壞血酸和0.1 g 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，混勻，加入40 mL無水乙醇，加入10 mL氫氧化鉀溶液，邊加邊振搖，混勻后于60 ℃恒溫水浴震蕩皂化45 min，皂化后立即用冷水冷卻至室溫。

（2）提取

將皂化液用30 mL蒸餾水轉(zhuǎn)入250 mL的分液漏斗中，加入50 mL石油醚，振蕩萃取5 min，將下層溶液轉(zhuǎn)移至另1 個250 mL的分液漏斗中，加入50 mL的石油醚再次萃取，合并醚層。

（3）洗滌

用約100 mL水洗滌醚層，約需重復(fù)3 次，直至將醚層洗至中性（可用pH試紙檢測下層溶液pH值），去除下層水相。

（4）濃縮

將洗滌后的醚層經(jīng)無水硫酸鈉（約3 g）濾入250 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，用約15 mL石油醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉2 次，并入蒸發(fā)瓶內(nèi)，并將其接在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于40 ℃水浴中減壓蒸餾濃縮，待瓶中醚液剩下約2 mL時，取下蒸發(fā)瓶，立即用氮氣吹至近干。用正己烷定容至2 mL，0.22 μm有機系濾膜過濾供半制備正相高效液相色譜系統(tǒng)使用的凈化待測液[9]。

1.2.3 色譜條件

（1）半制備正相高效液相色譜條件：a）色譜柱：硅膠柱，柱長250 mm ，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm；b）流速：1 mL/min；c）波長：264 nm。d）柱溫：25 ℃；e）進樣體積：500 μL。

（2）半制備正相高效液相色譜系統(tǒng)適用性試驗：取約1.00 mL維生素D3標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液于10 mL試管中，在40 ℃的氮吹儀上吹干。用10 mL正己烷振蕩溶解。取該溶液500 μL進行正相液相色譜儀測定，確定維生素D3保留時間。然后將500 μL待測液注入液相色譜儀中，根據(jù)維生素D3標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時間收集維生素D3餾分于試管中。將試管置于40 ℃水浴氮氣吹干，取出準(zhǔn)確加入1.5 mL甲醇振蕩溶解，即為維生素D3測定液。

（3）反相液相色譜條件：a）色譜柱：C18柱（柱長250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm）；b）柱溫：25 ℃；c）流動相：甲醇；d）流速：1.0 mL/min；e）紫外檢測波長：維生素D3為264 nm；f）進樣量：維生素D3為100 μL。

1.2.4 結(jié)果計算

試樣中維生素D的含量按下式計算：

X：試樣中維生素D2/D3的含量，單位為微克每百克（μg/100 g）；C：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的試樣中維生素D2/D3的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；V：正己烷定容體積，單位為毫升（mL）；f：待測液稀釋過程的稀釋倍數(shù)；100：試樣中量以每100 g計算換算系數(shù)；m：試樣的稱樣量，單位為克（g）；計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字[10，11]。

2 結(jié)果分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及樣品定量重復(fù)性

根據(jù)《GB 5009.82—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中維生素A、D、E的測定》（第四法 食品中維生素D的測定 高效液相色譜法）的要求，測量范圍應(yīng)覆蓋方法的最低濃度水平（定量限）和關(guān)注濃度水平，確定維生素D3標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍為0.0101 μg/mL，0.0253 μg/mL，0.1012 μg/mL，0.2024 μg/mL，0.3036 μg/mL，0.5060 μg/mL（濃度均經(jīng)過分光光度計校正）測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，每一點濃度測定3次，使用3 次數(shù)據(jù)擬合得到線性參數(shù)，各濃度點對應(yīng)的濃度和峰面積見表1。

表1 維生素D3標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與對應(yīng)峰面積

從試驗結(jié)果可見，得出維生素D3的擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為Y=3.3608X+0.0388，此時R2=0.999 1，大于0.99，濃度范圍覆蓋關(guān)注濃度的0%~150%，滿足《GB/T 27417—2017合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》的要求。

采用標(biāo)準(zhǔn)偏差法，選擇陰性樣品（即試樣中本身不含有維生素D3）試樣，稱取10 份，每份稱取10.0 g左右，按標(biāo)準(zhǔn)方法進行檢測，按LOD的表示方法為3 s（表），LOQ為3 倍的LOD。

從試驗結(jié)果可見，稱樣量為10.0 g，定容體積為2 mL時，方法檢出限為0.303 μg/100 g，方法定量限為0.909 μg/100 g）。低于該方法規(guī)定的檢出限和定量限（稱樣量為10 g，定容體積為2 mL時，方法檢出限為0.7 μg/100g，方法定量限為2 μg/100g）。

圖1 維生素D3標(biāo)準(zhǔn)溶曲線

2.2 不同儲存時間維生素D3含量變化

選取的嬰配粉在4 種貯藏條件下，貯存4周，每周測定1 次維生素D3含量變化，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同品牌貯存期維生素D3含量變化

不同品牌在不同貯藏溫度下維生素D3含量有所不同，3 種品牌最初測定維生素D3含量分別為6.31 μg/100 g、6.20 μg/100 g、6.00 μg/100 g，由圖所示，在陰涼干燥處（4 ℃）、常溫（20 ℃）下，維生素D3含量隨時間變化較小，可忽略不計；在低溫（-18 ℃）及高溫（30 ℃）下，維生素D3含量隨時間變化含量有所下降。以上表明低溫和高溫均會對維生素D3含量有所影響，不利于奶粉貯藏。綜上所述，維生素D3貯藏最佳條件為陰涼干燥處[12，13]。

表2 維生素D3方法檢出限與定量限結(jié)果

3 小結(jié)

本文主要研究結(jié)果顯示，嬰配粉中的維生素D3含量在陰涼干燥環(huán)境下和常溫環(huán)境下幾乎沒有變化，但低溫和高溫均會影響維生素D3的含量，主要原因可能是低溫或高溫條件可引起維生素D3分解，導(dǎo)致其含量減少。維生素D3含量隨外界貯藏條件的變化在未來幾年仍將是受關(guān)注的研究領(lǐng)域[14]。