張國妤,盧 樂,黎巧信,陸宏偉

(1西安交通大學第一附屬醫(yī)院感染科，西安 710061；2西安交通大學第二附屬醫(yī)院普外科；*通訊作者,E-mail:luler2008@163.com)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染可以誘導機體產生急性和慢性肝病，對全球人群的健康產生了巨大影響。人群感染HBV后，部分可逐漸轉變?yōu)槁愿窝?chronic hepatitis, CH)，在體內免疫反應的介導下，可逐漸發(fā)展為肝硬化(cirrhosis of liver, LC)、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)，甚至重型肝炎[1]。HBV感染后能否被機體清除，與宿主的免疫功能強弱密切相關[2]。與免疫調節(jié)呈負性相關的幾個重要的免疫抑制性分子—程序性細胞死亡分子-1(programmed cell death-1, PD-1)、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4, CTLA-4)、T細胞免疫球蛋白及黏蛋白分子-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-3, TIM-3)越來越受到人們的關注[3,4]。這些分子高表達后，可引起T細胞、樹突狀細胞、單核細胞等免疫細胞功能下降，導致機體不足以抑制HBV的感染以及由這些感染造成的損傷[5]。

這些免疫抑制性分子不僅與病毒感染相關，也在腫瘤調控中發(fā)揮著重要作用，參與腫瘤細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞的免疫逃逸和免疫應答。許多研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境能影響某些免疫調節(jié)因子的功能，而這些因子通過調節(jié)機體免疫應答進而促進或者抑制腫瘤生長[6]。CTLA-4可以與T細胞表面的協(xié)同刺激分子受體(CD28)競爭結合抗原提呈細胞表面的CD80/86，抑制CD28傳導共刺激信號，阻止T細胞的增殖與活化。TIM-3則在維持免疫平衡和腫瘤免疫調節(jié)中發(fā)揮著重要作用，腫瘤細胞可利用該基因逃避機體的免疫監(jiān)視[4,7]。

HBV感染機體以后的臨床轉歸和HCC的發(fā)生發(fā)展不僅與宿主的免疫功能有關，也與遺傳因素密切相關。而在遺傳因素中，許多基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)與HBV感染的不同結局以及HBV感染相關性HCC相關[8,9]。在以前研究中，已證實CTLA-4 +49基因多態(tài)性與HBV感染相關，TIM-3 -1516 G/T基因多態(tài)性與HBV感染和HCC相關[8,9]。本研究擬進一步探討二者聯(lián)合與HBV感染及HCC的關系。

1 資料與方法

1.1 病例來源

收集西安交通大學第一附屬醫(yī)院2011年8月至2013年6月慢性HBV感染者439例(男333例，女106例)，年齡(39.34±13.16)歲。所有病例的診斷均符合2010年中華醫(yī)學會感染病學分會、肝病學分會聯(lián)合修訂的慢性乙型肝炎診斷標準，并排除合并其他肝臟疾病(甲型、丙型、丁型、戊型病毒性肝炎、藥物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、Wilson’s病)、可引起機體發(fā)生高代謝的疾病(包括糖尿病、獲得性免疫缺陷綜合征、甲狀腺功能亢進)、伴隨嚴重的心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)以及腎功能損害和年齡不滿18歲的患者。439例HBV感染者的臨床分型為無癥狀攜帶者(asymptomatic carriers，ASC)48例，慢性肝炎154例，肝硬化134例和肝癌103例。健康對照者220例(男163例，女57例)，為中國陜西籍或長期居住在陜西地區(qū)無血緣關系的健康獻血員和健康體檢者，年齡(38.68±14.09)歲。兩組間年齡和性別的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。所有研究對象均知情同意和自愿參加。

1.2 主要試劑

購買北京天根生化科技有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒，購買西安潤德生物技術有限公司的2×Taq PCR Mix，購買大連寶生物工程有限公司DNA Marker。

1.3 DNA提取

所有受試者清晨空腹抽全血2 ml，用EDTA抗凝，-20 ℃保存待提取人類基因組DNA。用天根血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。按說明書操作步驟如下：①取200 μl加入EDTA抗凝劑的血液，加入1.5 ml的離心管中，向管中加入20 μl蛋白酶K溶液，混勻。②加入200 μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，70 ℃放置10 min。③加入200 μl無水乙醇，充分振蕩混勻15 s。④將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。⑤向吸附柱CB3中加入500 μl緩沖液GD(已加入無水乙醇)，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。⑥向吸附柱CB3中加入700 μl漂洗液PW(已加入無水乙醇)，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。⑦向吸附柱CB3中加入500 μl漂洗液PW，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液。⑧將吸附柱CB3放回收集管中，12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。⑨將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50～200 μl洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。離心管中收集的液體即是洗脫下來的基因組DNA，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因型分析

CTLA-4 +49 A/G(rs231775)和TIM-3 -1516 G/T(rs10053538)多態(tài)性的基因型分別采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)技術進行分析[9,10]。引物序列、內切酶、產物長度見表1。

表1 CTLA-4和TIM-3基因多態(tài)性使用的引物序列、內切酶、PCR產物長度

使用上述引物進行PCR反應，反應體系如下：DNA 6.0 μl，2×Master Mix 12.5 μl，上下游引物各1.0 μl，ddH20 4.5 μl，總體系25 μl；反應條件如下：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，64 ℃(CTLA-4 +49 A/G)或59 ℃(TIM-3 -1516 G/T)退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃延伸10 min，共30個循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 16.0軟件(SPSS，Inc.，Chicago，IL)進行統(tǒng)計分析?；蛐皖l率用Hardy-Weinberg平衡檢驗。采用χ2檢驗分析基因型頻率、等位基因頻率在HBV感染組與對照組的分布情況以及在肝癌組與非肝癌組的分布情況。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CTLA-4和TIM-3的基因型和等位基因

HBV感染組的CTLA-4 +49 GA、AA基因型和含A基因型(GA+AA)頻率高于對照組(P<=0.001)。HBV感染組的CTLA-4 +49 A等位基因頻率高于對照組(P<0.001)。HBV感染組的TIM-3 -1516 GT基因型和含T基因型(GT+TT)頻率高于對照組(P<0.001)。HBV感染組的TIM-3 -1516 T等位基因頻率高于對照組(P=0.002，見表2)。

表2 CTLA-4和TIM-3基因型和等位基因頻率分析 頻次(%)

2.2 CTLA-4和TIM-3基因型的聯(lián)合作用

以HBV易感基因型CTLA-4 +49 AA/TIM-3 -1516 GT+TT作為參照，基因型組合在HBV感染組和對照組之間無顯著差異。由于CTLA-4 +49 AA/TIM-3 -1516 GT+TT基因型數(shù)量太少，將CTLA-4 +49 AA和AG基因型合并后，CTLA-4 +49 AA+AG/TIM-3 -1516 GG、CTLA-4 +49 GG/TIM-3 -1516 GG基因型組合在HBV感染組中的分布頻率低于對照組(分別為P=0.048和P<0.001，見表3)，即基因型組合CTLA-4 +49 AA+AG/TIM-3 -1516 GT+TT在HBV感染組中的分布頻率更高。

表3 CTLA-4和TIM-3在HBV感染組和對照組的基因型組合頻率分析 頻次(%)

2.3 CTLA-4和TIM-3基因型和等位基因與疾病嚴重程度的關系

將HBV感染組按疾病嚴重程度分為無癥狀攜帶者(ASC)組、慢性肝炎(CH)組、肝硬化(LC)組和肝癌(HCC)組，CTLA-4 +49基因型和等位基因頻率在各組間差異有統(tǒng)計學意義，TIM-3 -1516在各組間無顯著性差異(見表4)。

表4 CTLA-4和TIM-3在乙肝不同臨床診斷組的基因型和等位基因頻率分析 頻次(%)

TIM-3 -1516基因型和等位基因進一步組間分析，HCC組的GT+TT基因型頻率高于CH組(P=0.039,OR=1.923,95%CI 1.027～3.603)。HCC組的T等位基因頻率高于CH組(P=0.034,OR=1.869,95%CI 1.039～3.361)。提示攜帶有T的基因型(GT+TT)和T等位基因可能與肝癌相關。

CTLA-4 +49基因型和等位基因進一步組間分析，ASC組的GA、AA、GA+AA基因型頻率高于HCC組(分別為P=0.005,OR=3.279,95%CI 1.387～7.752;P=0.002,OR=4.821,95%CI 1.670～13.918和P=0.001,OR=3.637,95%CI 1.599～8.274)，CH組的GA、AA、GA+AA基因型頻率高于HCC組(分別為P<0.001,OR=2.842,95%CI 1.610～5.017;P=0.007,OR=2.892,95%CI 1.313～6.373；P<0.001,OR=2.854,95%CI 1.662～4.900)，LC組的GA、AA、GA+AA基因型頻率高于HCC組(P=0.028,OR=1.885,95%CI 1.068～3.328;P=0.041,OR=2.260,95%CI 1.024～4.988；P=0.012,OR=1.972,95%CI 1.154～3.371)。ASC組的A等位基因頻率高于HCC組(P=0.001,OR=2.250,95%CI 1.373～3.689)，CH組的A等位基因頻率高于HCC組(P=0.001,OR=1.813,95%CI 1.258～2.613)，LC組的A等位基因頻率高于HCC組(P=0.016,OR=1.586,95%CI 1.088～2.311)。提示GG基因型和G等位基因可能與肝癌相關。

2.4 CTLA-4和TIM-3基因型組合與疾病嚴重程度的關系

以肝癌相關基因型CTLA-4 +49GG/TIM-3 -1516 GT+TT作為參照，基因型組合在各組間的差異有統(tǒng)計學意義(見表5)。進一步組間分析，CTLA-4 +49 GA/TIM-3 -1516 GG和CTLA-4 +49 AA/TIM-3 -1516 GG基因型組合在CH組的分布頻率高于HCC組(分別為P=0.001,OR=5.214,95%CI 1.822～14.921和P=0.007，OR=4.924，95%CI 1.484～16.340)。

表5 CTLA-4和TIM-3在乙肝不同臨床診斷組的基因型組合頻率分析 頻次(%)

由于CTLA-4 +49 GG/TIM-3 -1516 GT+TT基因型組合例數(shù)太少(在ASC組為0)，進一步將攜帶有CTLA-4 +49肝癌相關基因，即GG和GA基因型合并，基因型組合在各組間的差異有統(tǒng)計學意義(見表5)。進一步組間分析，CTLA-4 +49 GG+GA/TIM-3 -1516 GG、CTLA-4 +49 AA/TIM-3 -1516 GT+TT和CTLA-4 +49 AA/TIM-3 -1516 GG基因型組合在ASC組的分布頻率高于HCC組(分別為P=0.023,OR=4.000,95%CI 1.122～14.256;P=0.010,OR=12.000,95%CI 1.392～103.480和P=0.008,OR=6.545,95%CI 1.477～29.009)。CTLA-4 +49 AA/TIM-3 -1516 GG基因型組合在CH組的分布頻率高于HCC組(P=0.031，OR=2.727，95% CI 1.082～6.876)。

2.5 CTLA-4和TIM-3基因型與肝癌的關系

以HCC易感基因型CTLA-4 +49 GG作為參照，非HCC組(ASC、CH和LC患者)的GA基因型和AA基因型頻率高于HCC組(分別為P<0.001和P=0.003)。以HCC易感基因型TIM-3 -1516 GT+TT作為參照，非HCC組的GG基因型頻率高于HCC組(P=0.042，見表6)。

表6 CTLA-4和TIM-3基因型頻率與肝癌的關系 頻次(%)

進一步基因型組合分析，CTLA-4 +49 GA/TIM-3 -1516 GG和CTLA-4 +49 AA/TIM-3 -1516 GG基因型組合在非HCC組的分布頻率高于HCC組(分別為P=0.001和P=0.003，見表7)。

表7 CTLA-4和TIM-3基因型組合頻率與肝癌的關系 頻次(%)

3 討論

CTLA-4是由CTLA-4基因編碼的一種跨膜蛋白質，主要表達于活化的T淋巴細胞表面，與T細胞表面的協(xié)同刺激分子受體(CD28)競爭，抑制T細胞的增殖與活化。其外顯子1的+49位點A/G突變會導致丙氨酸轉變?yōu)樘K氨酸，并增加了CTLA-4 mRNA和蛋白的表達，增強對T細胞活化的抑制作用[11]。CTLA-4 +49 A等位基因可能通過增加細胞表面CTLA-4的表達來抑制T細胞的增殖和活化，增加HBV的易感性[10]。TIM-3也是一種負性調節(jié)分子，表達于Th1細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞(DCs)、CD8+T細胞以及NK細胞等，與配體半乳糖苷酶結合蛋白9(galectin-9，Gal9)結合，參與調節(jié)細胞的凋亡和免疫耐受[12,13]。位于TIM-3啟動子區(qū)的-1516 G/T位點可能通過調節(jié)這些細胞因子，與疾病的易感性或耐受性有關[14,15]。本研究結果也證實CTLA-4 +49 AA基因型和A等位基因與慢性HBV感染發(fā)生相關，TIM-3 -1516含T基因型(GT+TT)和T等位基因也與HBV感染相關。基因型組合進一步增加了HBV感染的風險。CTLA-4 +49 AA+AG/TIM-3 -1516 GT+TT基因型組合分別增強了慢性乙型肝炎的發(fā)病風險,與CTLA-4 +49 AA+GG相比，OR從1.924增至4.131，與TIM-3 -1516 GG+TT基因型相比，OR從2.263增至4.131。因此，CTLA-4 +49基因與TIM-3 -1516基因結合時，它們的相互作用可能增加HBV感染的易感性。

免疫調節(jié)信號通路在腫瘤發(fā)生的調控中起著重要作用，參與腫瘤細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞的免疫逃逸和免疫應答。許多研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境可以影響某些免疫調節(jié)因子的功能，這些因子通過調節(jié)免疫應答促進或抑制腫瘤生長[16,17]。CTLA-4和TIM-3均屬于這一重要的免疫調節(jié)因子。降低CTLA-4的表達可增強T細胞功能，增強機體的抗腫瘤免疫功能和抗癌能力。位于CTLA-4外顯子區(qū)的+49位點基因多態(tài)性同樣會通過影響蛋白質的氨基酸序列而影響CTLA-4蛋白的表達，在肺癌、結直腸癌以及肝癌等腫瘤中均有研究，CTLA-4 +49GG基因型和G等位基因與肝癌、結直腸癌、肺癌的易感性相關[18-20]。TIM-3也與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、臨床分期和腫瘤浸潤密切相關，高水平TIM-3預示腫瘤惡性度較高，患者的總體生存率更低且預后差[21,22]。而TIM-3的基因多態(tài)性也與許多腫瘤的發(fā)生密切相關。胃癌患者的TIM-3 -574G/T，-882C/T、-1516G/T基因多態(tài)性與胃癌顯著相關，+4259 G/T基因型與胃癌的遠處轉移有關[23]。TIM-3 -1516G/T多態(tài)性也與HCC的一些性狀相關，包括腫瘤分級和淋巴結轉移[9]。近期，也有一項meta分析證實，TIM-3 -1516 G/T基因位點與人類許多癌癥的風險增加有關[24]。本研究結果與上述結果也是一致的。CTLA-4 +49 GG基因型、G等位基因，TIM-3 -1516含T基因型(GT+TT)和T等位基因與HCC的發(fā)生相關。當CTLA-4和TIM-3基因型組合后，基因型組合也增加了HCC的發(fā)生風險。CTLA-4 +49 GG/TIM-3 -1516 GT+TT基因型組合分別增強了HCC的發(fā)病風險,與CTLA-4 +49 GG基因型相比，OR從2.798增至4.032，與TIM-3 -1516 GT+TT基因型相比，OR從1.725增至4.032。

但是，本研究也存在不足之處：首先，研究樣本比較小，HBV感染組為439例，因此，在進一步分組和基因分型后，每個組別的例數(shù)比較少，有些組別數(shù)只有1個或0個，在分析時需要將這些組與其他組合并后進行分析。第二，本研究為單中心研究，研究隊列僅為西安交通大學第一附屬醫(yī)院的研究人群，大規(guī)模的多中心的病例對照研究將會更有說服力。

總之，CTLA-4和TIM-3的表達水平、遺傳變異與慢性HBV感染和HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關，為從基因水平探討HBV感染易感性、疾病進展以及結局提供依據(jù)。在本研究基礎上，進一步進行大樣本多中心的隊列研究，探討多個基因的協(xié)同或阻遏作用，有助于從多基因角度了解HBV感染發(fā)生和發(fā)展的機制，為HBV感染基于基因信息的個體化防治提供新的策略。