潘云翠，王 倩，王守梅，胡愛艷，徐 怡，聶笑宇，張 鑫，張樹輝

2020年全球惡性腫瘤統(tǒng)計報告顯示，乳腺癌新發(fā)病例數(shù)226.1萬例，發(fā)病率為11.7%，已超過肺癌成為發(fā)病率最高的惡性腫瘤；死亡病例數(shù)68.4萬例，病死率為6.9%，位居惡性腫瘤病死率的第四位，嚴重危害女性身心健康[1]。盡管乳腺癌的診斷和治療方法不斷改善，仍需深入探討乳腺癌發(fā)病的分子機制，為研制疫苗和分子靶向治療提供依據(jù)。人子宮頸癌基因(human cervical cancer oncogenes, HCCRs)定位于人染色體的12q，編碼HCCR-1和HCCR-2兩種蛋白[2]。其中HCCR-1基因包含9個外顯子，編碼的蛋白質(zhì)包括360個氨基酸，相對分子質(zhì)量為4.2×104。HCCR-1在多種腫瘤中高表達。文獻報道食管鱗狀細胞癌中HCCR-1高表達，并且HCCR-1表達越高，患者的生存率越低[3]。本文采用免疫組化法檢測HCCR-1在乳腺癌組織中的表達，以及應(yīng)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)HCCR-1表達對乳腺癌細胞株增殖、凋亡和遷移的影響，探討HCCR-1在乳腺癌中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑MCF-7細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)；Opti-MEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(北京索萊寶公司)；蛋白裂解液(康為世紀公司)；兔抗人HCCR-1抗體(美國Affinity Biosciences公司)；GAPDH抗體(美國PTG公司)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑和實時熒光定量PCR試劑(日本Dojindo公司)。ER和PR(福州邁新公司)、HER-2(廈門艾德生物公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)人乳腺癌細胞株MCF-7用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素)在37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 免疫組化選取2016～2021年上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科存檔的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌及癌旁正常乳腺組織160例，本實驗經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會批準。免疫組化染色使用Leica Bond Max全自動免疫組化儀進行染色。HCCR-1陽性定位于細胞質(zhì)。免疫組化結(jié)果根據(jù)參考文獻判讀[4]。HER-2 FISH結(jié)果根據(jù)診斷標準[5]進行判讀。所有切片均由2位病理科主治醫(yī)師獨立閱片判讀。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染及qRT-PCR驗證HCCR-1-siRNA真核表達載體的構(gòu)建。靶向設(shè)計HCCR-1-siRNA 3個(表1)。用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細胞，提取轉(zhuǎn)染細胞總RNA，qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率。以GAPDH為內(nèi)參，每組設(shè)3個復(fù)孔。qRT-PCR引物序列：GAPDH上游5′-GAGTCCACTGGCGTCTTCAC-3′，下游5′-ATCTTGAGGCTGTTGTCATACTTCT-3′；HCCR-1上游5′-GTGGTAACCAAGACAAAAGCGA-3′，下游5′-GCATCAGC CCATAACATCTGC-3′。引物由上海生工生物公司合成。實驗分成三組：不做任何處理的空白組(NC)，轉(zhuǎn)染陰性的對照組(siRNA-NC)和轉(zhuǎn)染組(siRNA-HCCR-1)。后續(xù)實驗選用轉(zhuǎn)染效果最好的siRNA進行。

表1 HCCR-1 siRNA序列

1.5 Western blot法提取三組細胞總蛋白，測定蛋白濃度，進行蛋白變性，上樣，轉(zhuǎn)膜，免疫反應(yīng)(依次加入一抗、二抗)，化學(xué)發(fā)光和凝膠圖像分析。

1.6 細胞增殖檢測將轉(zhuǎn)染好的細胞以1×104個/孔的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，換液，分別在0、24、48、72 h用CCK-8法檢測各組細胞增殖能力的變化。

1.7 細胞凋亡檢測將轉(zhuǎn)染好的細胞培養(yǎng)48 h；消化收集細胞，加入Binding Buffer重懸細胞，并調(diào)節(jié)細胞濃度為1×106/mL；取100 μL細胞懸液，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide，混勻；加入Binding Buffer至500 μL，混勻；流式細胞儀檢測。

1.8 Transwell遷移檢測細胞株用無血清培養(yǎng)基饑餓處理。制備細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞濃度至1×105/mL。接種細胞，往每孔小室中加入200 μL細胞懸液(24孔小室)，往下室中加入500 μL含10% FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。結(jié)晶紫染色，拍照，計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中HCCR-1表達及其與臨床病理特征的關(guān)系HCCR-1表達定位于細胞質(zhì)，呈黃色或棕黃色。與癌旁正常組織相比(圖1A)，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中HCCR-1表達多呈棕黃色(圖1B)，表達量明顯升高，兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，表2)。HCCR-1表達與臨床分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER表達、PR表達相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、腫瘤最大徑、HER-2表達無關(guān)(P>0.05，表3)。

表2 癌旁正常組織和乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中HCCR-1的表達

表3 HCCR-1表達與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系

AB

2.2 轉(zhuǎn)染結(jié)果及驗證結(jié)果轉(zhuǎn)染siRNA-HCCR-1進入MCF-7細胞48 h后，與siRNA-NC組相比，siRNA-598、siRNA-673、siRNA-929組HCCR-1 mRNA的表達明顯下調(diào)(P<0.001，圖2)。Western blot結(jié)果顯示，siRNA-HCCR-1組與siRNA-NC組相比，HCCR-1蛋白表達下調(diào)(P<0.001，圖3)。

圖2 A.HCCR-1 siRNA轉(zhuǎn)染進入MCF-7細胞；B.qRT-PCR檢測MCF-7中HCCR-1 siRNA對HCCR-1 mRNA的干擾效率

圖3 Western blot法檢測MCF-7中siRNA-HCCR-1對HCCR-1蛋白的干擾效率：與siRNA-NC組比較，***P<0.001

2.3 細胞增殖檢測結(jié)果轉(zhuǎn)染48 h時，siRNA-HCCR-1組細胞增殖活性下降(P<0.05)；轉(zhuǎn)染72 h時siRNA-HCCR-1組細胞增殖活性明顯下降(P<0.01，圖4)。

圖4 CCK-8法檢測干擾HCCR-1表達對MCF-7細胞活力的影響：與siRNA-NC組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4 細胞凋亡檢測結(jié)果干擾HCCR-1后，與siRNA-NC組相比，siRNA-HCCR-1組細胞的凋亡明顯增加(P<0.001，圖5)。

圖5 流式細胞術(shù)檢測干擾HCCR-1表達對MCF-7細胞凋亡的影響：與siRNA-NC組比較，***P<0.001

2.5 細胞遷移檢測結(jié)果干擾HCCR-1后，與NC組相比，siRNA-NC組乳腺癌細胞的遷移差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與siRNA-NC組相比，siRNA-HCCR-1組細胞遷移到下層小室的細胞明顯減少(P<0.01，圖6)。

圖6 細胞遷移實驗檢測干擾HCCR-1表達對MCF-7細胞遷移的影響：與siRNA-NC組比較，**P<0.01

3 討論

據(jù)2015年國家癌癥中心統(tǒng)計，我國乳腺癌的發(fā)病率為37.86/10萬，病死率為9.21/10萬，每年因乳腺癌死亡的人數(shù)約6.0萬，5年生存率約為72.7%[6]。隨著我國社會、經(jīng)濟的發(fā)展，乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，給社會和家庭帶來了沉重的醫(yī)療負擔[7]。因此，尋找新的乳腺癌治療靶點，成為目前的研究熱點。

本實驗結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，HCCR-1在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中高表達。HCCR-1在多種惡性腫瘤中均高表達。HCCR-1在胰腺癌中高表達，尤其是在分化差的胰腺癌，表達更高；HCCR-1表達增高后胰腺癌細胞的增殖能力增強，干擾HCCR-1表達后胰腺癌細胞的增殖和遷移能力下降[8]。Wang等[9]報道骨化三醇可以抑制子宮頸癌的增殖，下調(diào)HCCR-1表達；而過表達HCCR-1可下調(diào)細胞周期抑制相關(guān)蛋白p21的表達，逆轉(zhuǎn)骨化三醇的抑制作用。Zhu等[10]報道HCCR-1在胃癌中高表達，并與術(shù)后不良預(yù)后有關(guān)；在體外，過表達HCCR-1可促進胃癌細胞的增殖和克隆形成率；在體內(nèi)，過表達HCCR-1增加荷瘤裸鼠的瘤重和體積。Meng等[11]研究顯示：與癌旁正常組織相比，HCCR-1在結(jié)腸癌中高表達，并與其發(fā)展和早期診斷相關(guān)。Zhang等[12]報道lncRNASNHG1在子宮頸癌中高表達；在體外，敲減SNHG1可上調(diào)miR-194的表達和下調(diào)HCCR-1的表達，從而抑制子宮頸癌的增殖；在體內(nèi)，敲減SNHG1后HCCR蛋白表達下調(diào)，瘤體體積明顯減小。HCCR-1在早期、腫瘤直徑<2 cm的肝癌患者血清中高表達[13]。Jung等[14]研究顯示HCCR-1在乳腺癌患者血清中高表達，可作為乳腺癌早期診斷的標志物[14]。據(jù)Ha等[15]報道，HCCR-1在乳腺癌中高表達，并與乳腺癌中ER、PR、HER-2、p53蛋白的表達相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，HCCR-1表達與乳腺癌臨床分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER表達、PR的表達相關(guān)，與患者年齡、腫瘤直徑、HER-2的表達無關(guān)。這與Meng等[11]及Ha等[15]報道HCCR-1表達與乳腺癌中ER、PR表達相關(guān)的結(jié)果基本一致。本實驗結(jié)果顯示，HCCR-1表達與HER-2表達無關(guān)，這與Ha等的報道不一致，可能與本實驗HER-2陽性病例數(shù)較少有關(guān)。有研究報道抑制乳腺癌細胞增殖，促進其凋亡是治療乳腺癌的重要策略[16-18]。本實驗結(jié)果顯示，干擾HCCR-1表達后乳腺癌細胞的增殖活性降低，凋亡細胞增多。這與Zhu等[10]在胃癌細胞中的研究結(jié)果一致：在體外，過表達HCCR-1可促進胃癌細胞的增殖。HCCR-1促進紫外線或十字孢堿誘導(dǎo)的人胚腎293細胞的凋亡[19]。在耐5-FU人胃癌細胞株中，HCCR mRNA高表達。沉默HCCR-1顯著降低了HGC-27-R細胞對5-FU的耐藥性。Zhang等[20]研究顯示，下調(diào)HCCR-1表達后，p-STAT3蛋白表達下調(diào)，并抑制胃癌細胞的增殖，促進其凋亡。此外，干擾HCCR-1表達可以促進乳腺癌細胞的凋亡、抑制其增殖；并且這種作用與乳腺癌細胞中Bax的表達上調(diào)有關(guān)[4]。乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的重要原因[21]。從基因水平抑制腫瘤細胞的遷移是防止腫瘤轉(zhuǎn)移的策略之一。干擾HCCR-1的表達可以降低胰腺癌細胞的遷移能力[7]。下調(diào)miR-20b表達，可通過上調(diào)TCF21抑制肝癌細胞HuH-7的增殖、遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[22]。武艷等[23]報道干擾UHMK1表達可使乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖、遷移及侵襲能力顯著下調(diào)。本實驗結(jié)果顯示，干擾HCCR-1表達后乳腺癌細胞的遷移能力下降。這表明HCCR-1是治療乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在靶點。

綜上，HCCR-1在乳腺癌中高表達，HCCR-1表達與臨床分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER表達、PR表達相關(guān)。干擾HCCR-1表達可以抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移，促進其凋亡，HCCR-1有望成為乳腺癌基因治療的新靶點。