陶月佳，趙 媛，李 冰，徐遠義，黃允寧

胃癌是人類常見的惡性腫瘤之一[1]，發(fā)病率位居惡性腫瘤第6位，病死率居第3位[2]。目前，超過60%的胃癌發(fā)生在東亞地區(qū)，并且隨著人口老齡化日益加重，胃癌的發(fā)病率和病死率仍在增加[3]。最近研究顯示，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)在生物生長、發(fā)育、衰老及死亡過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用[4]，是表觀遺傳、轉錄和轉錄后水平的關鍵調節(jié)因子[5]。此外，一些lncRNA還是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵因子[6]。LINC00659是一種致癌lncRNA，目前對其研究并不廣泛。文獻報道LINC00659在結腸癌中的表達水平顯著升高，其高表達與結腸癌患者預后不良相關[7]。本實驗通過檢測LINC00659在胃癌組織和人胃癌細胞株中的表達，并探討其通過調控PI3K/AKT信號通路對胃癌細胞增殖的影響，旨在為胃癌的臨床治療提供潛在的靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2020年1～11月寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院手術切除的29例胃癌組織及距癌灶切緣2～5 cm處的正常胃組織。所有患者術前均未行放、化療或免疫治療。本實驗通過寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與慢病毒感染 采用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，雙抗?jié)舛葹榍嗝顾?00 U/mL、鏈霉素100 ng/mL)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至融合度達80%～90%時，胰蛋白酶消化，常規(guī)傳代培養(yǎng)。選對數(shù)生長期的胃癌細胞株AGS，用無血清基礎培養(yǎng)基制備成(3～5)×105/mL的細胞懸液，接種于96孔板，保持細胞狀態(tài)良好(形態(tài)清晰、生長正常、無污染)，平行感染2～3個復孔，以減小誤差。使用不含抗生素的完全培養(yǎng)基將慢病毒滴度稀釋為1×106TU/mL、1×107TU/mL、1×108TU/mL各50 μL。去除培養(yǎng)基，依次向各孔中加入不同滴度慢病毒、感染增強液和完全培養(yǎng)基，輕輕“8字”搖勻后放入培養(yǎng)箱。培養(yǎng)12～16 h后去除含有病毒的培養(yǎng)基，加入100 μL新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，于熒光顯微鏡下初步觀察感染效率。選擇感染效率約80%、使用慢病毒最少、細胞生長良好和病毒感染復數(shù)(MOI)作為后續(xù)感染的依據(jù)，計算公式：病毒體積=(MOI×細胞數(shù)目)/病毒滴度。

人正常胃上皮細胞GES-1和人胃癌細胞系AGS、HGC-27均購自上海中科院細胞庫。敲減組(轉染LINC00659 siRNAs)和空載組(轉染陰性對照)，過表達組(轉染lv-LINC00659)和空載組(轉染陰性對照)由吉凱基因公司(中國上海)合成。序列詳見表1。

表1 siRNAs及其序列

1.2.2Western blot法 當細胞生長至融合度達80%～90%時收集細胞，加RIPA裂解液在冰上裂解，反復渦旋5次后，4 ℃離心10 min，吸取上清液，并采用BCA蛋白定量法準確測量蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液(Lodding buffer)，100 ℃加熱10 min，取40 μg蛋白進行10%SDS-PAGE凝膠電泳。電泳分離蛋白樣品后，轉膜至0.45 μm的PVDF膜上，用TBST稀釋，10%脫脂牛奶室溫下封閉1.5 h，以減少非特異性抗原決定簇的結合。封閉后加入一抗Ki-67、PCNA、PI3K、p-AKT(Ki-67和PCNA，中國武漢Proteintech公司；PI3K，ab278545，英國Abcam公司；p-AKT，Ser473，美國Cell Signaling Technology公司)，4 ℃過夜。二抗室溫孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min。滴加顯影液于顯影儀中曝光。獲得條帶后采用Image J軟件系統(tǒng)分析灰度值。以β-tubulin和GAPDH作為內參照物，目的蛋白/β-tubulin或GAPDH灰度值表示目的蛋白的相對表達量。實驗獨立重復3次。

1.2.3qRT-PCR 組織和細胞總RNA提取使用Trizol(Thermo Fisher Scientific)試劑，按照試劑盒說明進行總RNA提取，檢測RNA濃度和純度后，使用PrimeScript試劑(日本Takara公司，RR036A)反轉錄成cDNA(反應條件為42 ℃ 1 h，72 ℃ 10 min)。以100 ng cDNA為模板，按熒光定量試劑盒SYBR Green Master Mix(日本Takara公司，RR820A)說明書配制定量PCR反應體系，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。在熒光定量PCR儀上設置反應條件，對擴增產物進行定量分析。以GAPDH為內參，采用相對定量方法RQ=2-ΔΔCt計算LINC00659相對表達量。所有引物均由上海生工生物公司合成。LINC00659引物序列：正向5′-ACCCCTGAAGGAC CATATCCA-3′，反向5′-GGCTCGGCTGTGTCTCAAG-3′；內參GAPDH引物序列：正向5′-CGACCACTTT GTCAAGCTCA-3′，反向5′-CCCTGTTGCTGTAGC CAAAT-3′。

1.2.4細胞增殖實驗 取對數(shù)生長期的AGS細胞接種于96孔板中培養(yǎng)，每次接種4個96孔板，調整細胞密度為(2～5)×105/mL，每孔加入100 μL細胞懸液，將細胞置于37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h，至細胞貼壁。在不同時間點(24、48、72、96 h)，按照每孔100 μL[90 μL新鮮培養(yǎng)基+10 μL CCK-8試劑(美國APExBIO公司)]加入96孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用多功能酶標儀檢測細胞450 nm處的吸光度(OD)值，繪制增殖曲線。實驗獨立重復3次。

1.2.5克隆形成實驗 取對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個懸浮細胞，接種到6孔板中(1 000個/孔)，輕輕搖勻，使細胞分散均勻。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～15天；當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄上清，用PBS小心浸洗3次；4%多聚甲醛固定30 min；棄固定液后PBS洗滌3次，加1 mL 0.1%結晶紫染色20 min，清水輕輕沖去結晶紫染液，PBS洗滌3次，空氣干燥，晾干。細胞克隆用相機拍照，并將平皿倒置記錄細胞克隆數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0軟件和GraphPad prism 8.0進行統(tǒng)計學分析和制圖。兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織及人胃癌細胞株中LINC00659的表達通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析LINC00659在胃癌組織與癌旁組織中的表達情況，結果顯示LINC00659在胃癌組織中高表達(P<0.05，圖1A)。qRT-PCR檢測結果顯示：與癌旁正常組織相比，LINC00659在29例胃癌組織中表達上調(P<0.01，圖1B)。此外，與人正常胃上皮細胞GES-1相比，人胃癌細胞AGS和HGC-27中LINC00659高表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖1C)。

圖1 胃癌組織和胃癌細胞系中LINC00659的表達：A.TCGA數(shù)據(jù)庫分析LINC00659在胃癌組織與癌旁正常組織中相對表達水平，*P<0.05；B.qRT-PCR檢測29例胃癌組織及癌旁正常組織中LINC00659相對表達水平；C. qRT-PCR檢測人正常胃上皮細胞GES-1、胃癌細胞系AGS和HGC-27中LINC00659的相對表達水平：與GES-1相比，**P<0.01

2.2 慢病毒轉染胃癌細胞效率鑒定為明確LINC00659在胃癌中的生物學功能，本實驗構建了差異表達LINC00659的慢病毒載體，并感染人胃癌細胞AGS和HGC-27，48 h后在熒光倒置顯微鏡下初步觀察轉染效率，通過qRT-PCR法檢測敲低或過表達LINC00659的轉染效率。結果顯示，敲減組AGS細胞中LINC00659表達水平明顯低于空載組，而過表達組HGC-27細胞中LINC00659表達水平明顯上調，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖2)。這表明慢病毒感染敲減LINC00659表達的AGS細胞模型和過表達LINC00659的HGC-27細胞模型構建成功。

圖2 驗證慢病毒轉染效率：A.慢病毒轉染構建敲減LINC00659的AGS細胞模型；B.慢病毒構建過表達LINC00659的HGC-27細胞模型

2.3 LINC00659對胃癌細胞增殖活力的影響通過CCK-8法對不同時間點(24、48、72和96 h)AGS和HGC-27細胞增殖活力進行測定。結果顯示，與空載組相比，敲減LINC00659組AGS細胞的增殖活力明顯降低(P<0.01，圖3A)，而過表達LINC00659組HGC-27細胞的增殖活力明顯增高(P<0.05，P<0.01，圖3B)。

圖3 CCK-8法檢測胃癌細胞的增殖活力：A.CCK-8法檢測敲減LINC00659組AGS的增殖活力；B.CCK-8法檢測過表達LINC00659組HGC-27的增殖活力；與空載組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.4 LINC00659對胃癌細胞集落形成能力的影響為進一步研究LINC00659對胃癌細胞增殖能力的影響，通過克隆形成實驗檢測胃癌細胞集落形成能力。結果顯示，與空載組相比，敲減LINC00659組AGS細胞集落形成能力顯著降低(P<0.01，圖4A)；過表達LINC00659可顯著促進HGC-27的集落形成能力(P<0.01，圖4B)。

圖4 克隆形成實驗檢測胃癌細胞集落形成能力：A.敲減LINC00659后AGS細胞集落形成能力；B.過表達LINC00659后HGC-27細胞集落形成能力

2.5 LINC00659對PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達的影響 本實驗通過Western blot法檢測胃癌細胞敲減或過表達LINC00659后胃癌細胞中PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達情況，結果顯示，與空載組相比，敲減LINC00659組AGS細胞中PI3K和p-AKT蛋白表達顯著降低，增殖相關標志物Ki-67和PCNA蛋白表達水平亦降低(圖5A、B)；相反，在胃癌HGC-27細胞中過表達LINC00659則逆轉了這一效應(圖5C、D)。上述實驗結果表明：LINC00659可能是通過調控PI3K/AKT信號通路磷酸化水平影響胃癌細胞增殖。

圖5 Western blot法檢測敲減或過表達LINC00659后PI3K、p-AKT及增殖相關標志物Ki-67和PCNA的表達：A.敲減LINC00659組AGS細胞中PI3K和p-AKT的表達；B.敲減LINC00659組AGS細胞中Ki-67和PCNA的表達；C.過表達LINC00659組HGC-27細胞中PI3K和p-AKT的表達；D.過表達LINC00659組HGC-27細胞中Ki-67和PCNA的表達

3 討論

胃癌是人類侵襲性和致死性較高的惡性腫瘤之一[8-9]。該病發(fā)病率高，早期診斷率低且預后差，嚴重威脅人類健康[10]。因此，尋找可靠的胃癌生物標志物對胃癌患者的診治和預后尤為重要。lncRNA作為癌癥早期篩查、預后評估以及對藥物治療反應的生物標志物引起廣泛關注[11-13]。如LINC00858在胃癌組織和人胃癌細胞中的表達明顯上調，并與患者預后不良有關[14]；lncRNA ROR可促進胃癌細胞增殖、遷移、侵襲和上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，此外lncRNA ROR高表達可促進胃癌細胞MRP1的表達和多藥耐藥，并與胃癌患者預后不良相關[15]。

LINC00659是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其在腫瘤特別是胃癌中的作用機制尚不清楚。Zhou等[16]研究發(fā)現(xiàn)，癌癥相關成纖維細胞衍生的外泌體可將LINC00659轉運至結腸癌細胞中，從而促進結腸癌的進展。Li等[17]研究證實，貝母素乙通過下調LINC00659表達上調miR-760，從而抑制結直腸癌的進展，提示LINC00659與腫瘤的進展相關。本實驗通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)LINC00659在胃癌組織中高表達；通過qRT-PCR證實LINC00659在胃癌組織及人胃癌細胞株中高表達，提示LINC00659在胃癌發(fā)生、發(fā)展中可能扮演著癌基因作用。Tsai等[7]在結腸癌中的研究表明，LINC00659可促進結腸癌細胞增殖和遷移。為探討LINC00659在胃癌中的可能作用機制，本組構建了敲減或過表達LINC00659人胃癌細胞模型，CCK-8法及克隆形成實驗結果表明，與空載組相比，敲減組細胞增殖和集落形成能力均被抑制，而過表達LINC00659則促進細胞增殖和集落形成能力，與文獻研究結果一致。

細胞增殖是腫瘤發(fā)展的關鍵影響因素，此過程中會涉及多種信號通路，彼此交叉，形成網(wǎng)絡樣聯(lián)系[18]。近年來研究較多的有關增殖的信號通路包括：MAPK通路[19]、PI3K/AKT信號通路[20-21]、Wnt/β-catenin信號通路[22]等。其中PI3K/AKT信號通路是癌癥中重要的信號網(wǎng)絡之一，該信號通路參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[23-24]。文獻報道PI3K/AKT信號通路與胃癌關系密切，對細胞增殖、血管生成和存活等生理病理條件具有重要意義[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)LINC00659潛在的作用機制之一是促進胃癌細胞增殖。為進一步探討LINC00659是否通過調控PI3K/AKT信號通路影響胃癌細胞的增殖，本實驗通過Western blot法檢測PI3K/AKT信號通路中PI3K、p-AKT蛋白以及增殖相關標志物Ki-67和PCNA的表達水平，結果顯示敲減LINC00659可顯著降低PI3K、p-AKT蛋白以及增殖相關標志物Ki-67和PCNA的表達。這一結果表明，LINC00659可能通過調控胃癌細胞中PI3K/AKT信號通路影響胃癌細胞增殖。

綜上，LINC00659在胃癌組織和胃癌細胞中高表達，其可以增強胃癌細胞增殖活力和集落形成能力，促進胃癌的惡性生物學行為，是參與胃癌發(fā)生、發(fā)展的功能基因。LINC00659可能通過激活PI3K/AKT信號通路發(fā)揮作用，進一步加深了我們對胃癌發(fā)生分子機制的認識。LINC00659有望成為胃癌治療的新靶點，為胃癌治療個體化方案的定制提供參考。