李翔宇 ，徐柳柳 ，舒敏 ，李慕梓 ，李博玲 ，汪志明 *

1. 嘉必優(yōu)生物技術(shù)（武漢）股份有限公司（武漢 430073）；2. 湖北省營養(yǎng)化學(xué)品生物合成工程技術(shù)研究中心（武漢 430223）；3. 中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究所（合肥 230031）；4. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)（合肥 230026）

唾液酸（sialic acid，SA）是一族神經(jīng)氨酸的氮或氧基取代的衍生物總稱，其衍生生物均為帶負電的九碳糖神經(jīng)氨酸[1]。SA廣泛存在于哺乳動物組織中，是糖蛋白、低聚糖和糖脂的重要組成部分[2]，參與細胞識別、生存、繁衍等作用[3]。脊椎動物和高等無脊椎動物體內(nèi)也含有豐富的SA[4-5]，如羊肉、牛肉[6]。母乳中唾液酸的含量遠高于牛乳[7-8]。關(guān)于SA的功效成為各大領(lǐng)域研究熱點。在疾病治療方面，有研究表明，SA具有抗腫瘤[9]、抗病毒[10]等功效。對于健康人群，有研究表明，SA與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育具有相關(guān)性[11-12]。故孕婦及嬰幼兒對SA的攝入量越來越受到關(guān)注。

近年來，固體飲料因其方便攜帶、品種豐富、易于保存等特點，受到越來越多消費者追捧。固體飲料通常分為蛋白型固體飲料和普通型固體飲料[13-14]。隨著人們對食品健康與營養(yǎng)越來越關(guān)注，固體飲料也朝著營養(yǎng)化、功能化方向發(fā)展，富含功能因子的固體飲料市場需求越來越大。外源性SA的供給，可提高動物大腦中神經(jīng)節(jié)苷酯的濃度，增進學(xué)習(xí)能力[15-16]。因此向固體飲料中添加SA，可以滿足繁忙的消費者同時追求口感價值和營養(yǎng)價值。許多固體飲料生產(chǎn)商將其中SA含量標示出來，以此作為產(chǎn)品亮點。因此，開發(fā)一種可靠、簡單易行的固體飲料中SA檢測的標準化方法可使固體飲料中的SA檢測規(guī)范化、科學(xué)化和系統(tǒng)化，為相關(guān)企業(yè)的研發(fā)及生產(chǎn)提供參考價值。

試驗分別利用液相色譜法（參照GB/T 30636—2014《燕窩及其制品中唾液酸的測定 液相色譜法》）、茚三酮顯色法、間苯二酚比色法、高效液相-紫外檢測法及高效液相-熒光檢測法檢測固體飲料中SA含量，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立一種簡單易行、準確度高，不受體系中雜質(zhì)干擾，可用于固體飲料中唾液酸含量檢測方法，為相關(guān)研究提供理論支持及技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

N-乙酰神經(jīng)氨酸標準品、DMB試劑、茚三酮、間苯二酚（阿拉丁）；某品牌茶粉；乙腈、甲醇、磷酸、乙酸（色譜純）；低亞硫酸鈉、2-巰基乙醇、硫酸銅、濃鹽酸、濃硫酸、乙酸丁酯、正丁醇、硫酸銅（分析純）；超純水。

UltiMate3000高效液相色譜儀，配熒光檢測器（美國Thermo公司）；高效液相Agilent1260色譜儀（配紫外檢測器，美國Agilent公司）；Zorbax SB-Aq色譜柱（4.6 mm×50 mm，美國Agilent公司）；色譜柱Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm，美國伯樂公司）；ZOBAX 300色譜柱SCX陽離子交換柱（4.6 mm×250 mm，美國Agilent公司）；3-18K高速冷凍干燥離心機（德國Sigma公司）；HH-2智能數(shù)顯恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）；XS105分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

精確稱取100 mg唾液酸標準品于100 mL容量瓶中，超純水溶解并定容。將標準儲備液按不同濃度梯度稀釋成系列工作曲線，超純水作試劑空白。同樣品處理方法處理。

1.2.2 液相色譜法

1.2.2.1 色譜條件

流動相，乙腈-0.1%磷酸水溶液（90∶10，體積比）；進樣量20 μL；流速1 mL/min；柱溫30±1 ℃；檢測波長205 nm。

1.2.2.2 樣品測定

定量稱取茶粉（精確至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中，加水至刻度處（使用溫水進行溶解，需保證樣品完全溶解）。按SA添加量將濃度稀釋至標曲范圍內(nèi)，準確量取10 mL于透析袋中，在流水下透析24 h，透析后，將其放浸泡于聚乙二醇溶液中，使水分滲出。將試液轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，并用少量水沖洗透析袋，合并試液。向其中加入乙酸，使其濃度為50%。將其置于100 ℃水浴鍋中，水浴10 min，取出比色管，冷卻至室溫。將水解液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用流動相定容，過膜，上機。

1.2.3 茚三酮顯色法

1.2.3.1 試劑配制

茚三酮顯色劑：2.5 g茚三酮溶于60 mL冰乙酸及40 mL濃鹽酸中。

1.2.3.2 樣品測定

定量稱取茶粉（精確至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中，加水至刻度處（使用溫水進行溶解，需保證樣品完全溶解）。按SA添加量將濃度稀釋至標曲范圍內(nèi)，取2 mL溶液于比色管中，向其中加入2 mL茚三酮顯色劑及2 mL冰乙酸，于100 ℃水浴鍋中水浴10 min。

1.2.4 間苯二酚顯色法測定茶粉中唾液酸含量

1.2.4.1 試劑配制

向50 mL容量瓶中依次加入250 μL 0.1 mol/L硫酸銅溶液、2.5 mL 4%間苯二酚和40 mL濃鹽酸，用超純水定容。搖勻避光備用。

萃取劑：乙酸丁酯和正丁醇按17∶3體積比配比。

1.2.4.2 樣品測定

定量稱取茶粉（精確至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中，加水至刻度處（使用溫水進行溶解，需保證樣品完全溶解）。按SA添加量將濃度稀釋至標曲范圍內(nèi)，定量取溶液于10 mL玻璃比色管中，向其中加入等量顯色劑。沸水浴1 h，于冰水中冷卻10 min。加入等量萃取劑，渦旋30 s后靜置10 min，待分層后取上層于585 nm波長處測吸光度。

1.2.5 HPLC-UV測茶粉中唾液酸含量

1.2.5.1 色譜條件

流動相為5 mmol/L硫酸-水溶液；進樣量10 μL；流速0.6 mL/min，柱溫60±1 ℃；檢測波長210 nm。

1.2.5.2 樣品測定

定量稱取茶粉（精確至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中，加水至刻度處（使用溫水進行溶解，需保證樣品完全溶解）。按SA添加量將濃度稀釋至標曲范圍內(nèi)，0.22 μm微孔濾膜過濾，供液相分析。

1.2.6 HPLC-FLD測茶粉中唾液酸含量

1.2.6.1 色譜條件

色譜條件：甲醇-0.05%乙酸水梯度洗脫，梯度條件表見表1，流動相A為0.05%乙酸水，流動相B為甲醇；進樣量10 μL；流速2 mL/min，柱溫30±1 ℃。

表1 色譜分離梯度條件

1.2.6.2 試劑配制

DMB試劑：向5 mL容量瓶中加入7.9 mg DMB試劑、264 μL 2-巰基乙醇、15.7 mg低亞硫酸鈉及400 μL冰乙酸，最后加蒸餾水定容。

1.2.6.3 樣品測定

定量稱取茶粉（精確至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中，加水至刻度處（使用溫水進行溶解，需保證樣品完全溶解）。按SA添加量將濃度稀釋至標曲范圍內(nèi)，經(jīng)離心處理后，取200 μL離心后的上清水解產(chǎn)物和相同體積的DMB溶液混合，在80 ℃下加熱50 min。衍生后的樣品冰浴冷卻，加入400 μL水使之稀釋?；靹蚝蠼?jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，供液相分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗結(jié)果

2.1.1 液相色譜法

將標準儲備液配制成質(zhì)量濃度10，20，40，60，80和100 μg/mL的系列標準工作液，超純水作試劑空白。以含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，得出回歸曲線y=13 204x+1 840.9（R2=0.999 8）。結(jié)果表明，在線性范圍10～100 μg/mL內(nèi)，該方法具有良好線性關(guān)系。由圖1可知，目標峰在10 min左右，但樣品圖（圖2）在目標位置僅出現(xiàn)一點谷峰，峰面積遠低于周圍雜質(zhì)峰，由此計算出的SA含量低于理論值的10%。故此方法不適合測茶粉中的SA，推測原因：向茶粉中添加SA的工藝多為干法添加，故體系中多為SA單體，其經(jīng)透析、水解，造成大量損失。

圖1 SA樣品液相圖

圖2 茶粉液相圖

2.1.2 茚三酮顯色法

將標準儲備液配成質(zhì)量濃度5，10，20，50和100 μg/mL的系列標準工作液，用超純水作試劑空白。以含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，得出回歸曲線y=0.008 1x+0.004 3（R2=1.000 0）。結(jié)果表明，在線性范圍5～100 μg/mL內(nèi)，該方法具有良好線性關(guān)系。在酸性條件下，SA與茚三酮反應(yīng)生成淡黃色絡(luò)合物，顏色隨著濃度增加而加深。研究發(fā)現(xiàn)，此方法測得的SA含量偏大，且結(jié)果波動較大。推測原因：茶粉體系中含有少量氨基酸，會與茚三酮發(fā)生反應(yīng)，影響試驗結(jié)果，試驗過程中需嚴格控制稱樣量。若無空白樣做本底扣除，無法計算SA添加量。

2.1.3 間苯二酚顯色法

將標準儲備液配成質(zhì)量濃度10，20，40，80和120 μg/mL的系列標準工作液，超純水作試劑空白。以含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，得出回歸曲線y=0.008 7x-0.010 6（R2=0.999 4）。結(jié)果表明，在線性范圍10～120 μg/mL內(nèi)，該方法具有良好線性關(guān)系。由圖3可以看出，SA標品溶液與間苯二酚反應(yīng)，生產(chǎn)藍色絡(luò)合物，且隨著濃度增加，顏色越深。而反應(yīng)后茶粉溶液呈現(xiàn)紅褐色，這可能是在酸性條件下茶粉中的酮糖與間苯二酚發(fā)生Seliwanoff反應(yīng)，生成紅色復(fù)合物[17]，進而對試驗造成嚴重干擾。故間苯二酚方法不適合成分復(fù)雜的茶粉中SA含量檢測。由此可知，間苯二酚顯色法不適合測定體系中含有酮糖的SA樣品。

圖3 間苯二酚法測茶粉結(jié)果圖

2.1.4 HPLC-UV結(jié)果分析

將標準儲備液配成質(zhì)量濃度0.01，0.10，0.20，0.50和1.00 mg/mL的系列標準工作液，超純水作試劑空白。以含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，得出回歸曲線y=174.732 7x+1.315 2（R2=0.999 9），且峰型完整。結(jié)果表明，在線性范圍0.01～1 mg/mL內(nèi)，該方法具有良好線性關(guān)系。由圖4可以看出，茶粉中SA經(jīng)Aminex HPX-87H色譜柱分離后，在7.67 min處出峰，但目標峰存在拖尾、與鄰近峰難分等問題，給結(jié)果分析帶來很大干擾。原因可能是茶粉中含有的一些共軛基團在210 nm處也產(chǎn)生紫外吸收，使峰型出現(xiàn)拖尾，從而對檢測結(jié)果有干擾，故HPLC-UV方法不適宜用來測定茶粉中SA含量。

圖4 茶粉HPLC-UV色譜圖

2.1.5 HPLC-FLD結(jié)果分析

將標準儲備液配成質(zhì)量濃度0.5，1.0，2.0，5.0和10.0 μg/mL的系列標準工作液，超純水作試劑空白。以含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，得出回歸曲線y=30 383.436 7x+1 529.311（R2=0.999 9）。結(jié)果表明，在線性范圍0.5～10 μg/mL內(nèi)，該方法具有良好線性關(guān)系。由圖5可看出，1.597 min為目標峰。茶粉中SA與DMB衍生液在酸性條件下生成具有熒光特性的衍生物，在Zorbax SB-Aq色譜柱分離后，經(jīng)337 nm激發(fā)光激發(fā)后、在448 nm處產(chǎn)生可識別、定量的熒光信號，峰型完整，與雜質(zhì)峰分離良好?？捎行П苊庾贤鈾z測器出現(xiàn)的峰拖尾現(xiàn)象，這與熒光檢測器高選擇性、高靈敏度有關(guān)。

圖5 茶粉HPLC-FLD色譜圖

綜上，HPLC-FLD檢測法測定茶粉中SA含量具有良好的分離效果和較高的靈敏度。故后期可選定該方法測定固體飲料中SA含量測定。

2.2 HPLC-FLD凈化條件優(yōu)化

茶粉溶液中含有的蛋白質(zhì)、脂肪等大分子會對后期分析產(chǎn)生干擾，故需要對樣品溶液進行凈化。分別選用Amicon Ultra-1530超濾離心管在4 000 r/min離心10 min及普通離心管在15 000 r/min下離心10 min對樣品進行處理。

比較圖6和圖7可以得出，樣品經(jīng)超濾離心管離心后，峰型更完整，與周圍雜質(zhì)峰分離更好。經(jīng)過離心管離心后的樣品色譜圖雜質(zhì)更多，雜質(zhì)峰干擾作用更大，且在目標峰旁邊總存在一個較小的峰，對分析造成干擾。這說明超濾離心管對茶粉溶液的除雜作用更好，故后續(xù)試驗選用超濾離心管凈化樣品。

圖6 超濾后茶粉HPLC-FLD色譜圖

圖7 離心后茶粉HPLC-FLD色譜圖

2.3 檢出限

以標準品色譜峰的信噪比等于3（S/N=3）對應(yīng)的濃度為方法的檢出限（SLOD），S/N=10對應(yīng)的質(zhì)量濃度為方法的定量限（SLOQ），最終確定樣品中SLOD為0.2 mg/L、SLOQ為0.6 mg/L。

2.4 回收率和精密度

由于茶粉基質(zhì)復(fù)雜，因此基質(zhì)效應(yīng)會影響檢測結(jié)果的準確性，采用基質(zhì)加標標準曲線定量可消除基質(zhì)效應(yīng)對儀器檢測結(jié)果的影響。分別添加100，150和200 μL的10 μg/mL標準溶液于3種250 μL基質(zhì)溶液中，補水至500 μL，進行樣品處理，每個樣平行6次，結(jié)果如表2所示。方法的平均加標率為101%，SRSD平均值為9.31%，表明該方法測茶粉中唾液酸含量有較好的適用性。

表2 樣品加標回收率

3 結(jié)論

試驗選定的5種方法對SA標準品測定均有很好的線性關(guān)系，但液相色譜法由于反應(yīng)時間久、反應(yīng)過程長，造成SA單體大量損失，故不適用于含單體SA的固體飲料的含量檢測；茚三酮顯色法容易受茶粉中氨基酸等成分影響，在無空白樣品的情況下，無法計算SA添加量；間苯二酚法測茶粉中SA存在顯色異常的問題，HPLC-UV則存在色譜峰分離度不高，雜質(zhì)峰干擾等問題，故均不適合用于茶粉中SA含量檢測。HPLC-FLD能克服茶粉中糖類、蛋白等雜質(zhì)干擾等問題，具有重復(fù)性好、精密度高、回收率高、低檢出限、易操作等優(yōu)點，能準確地檢測茶粉中唾液酸的含量。市面上已涌現(xiàn)多種多樣的含SA產(chǎn)品，如益生菌固體飲料、果凍、美容口服液等，該方法均能滿足相關(guān)產(chǎn)品中SA含量的檢測要求，具有很好的應(yīng)用前景。