劉禹志 ，趙文俊，符樹勇 ，張誠 ，杜冰，方嘉沁 *

1. 廣州酒家集團利口福食品有限公司（廣州 511442）；2. 華南農(nóng)業(yè)大學食品學院（廣州 510642）；3. 廣州酒家集團糧豐園（茂名）食品有限公司（茂名 525000）；4. 廣州市廣式焙烤食品加工工程技術研究開發(fā)中心（廣州 511442）

龍眼、荔枝和芒果常見于我國海南、廣東等熱帶和亞熱帶省份，其果肉鮮嫩多汁、營養(yǎng)可口，它不僅富含鈣、鎂、磷等多種礦物質和核黃素、煙酸等維生素，還含有多種抗氧化活性物質如槲皮素、原花青素等類黃酮物質，對人體多有裨益[1-2]。龍眼（Dimocarpus longan Lour.）亦稱“桂圓”，盛產(chǎn)于我國華南地區(qū)。龍眼具有壯陽益氣、補心益脾、潤膚美容、延年益壽等功效，可以治療或改善貧血、心悸、神經(jīng)衰弱等癥狀[3]。芒果（Mangifera indicaL.）是我國廣西、海南、四川和云南等熱區(qū)農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)，芒果果實富含糖、蛋白質、粗纖維，并且所含有的維生素A的前體胡蘿卜素成分特別高，是所有水果中少見的。但是這些季節(jié)性水果采收后不易貯存而導致腐爛的問題，給食品工業(yè)造成巨大的損失[4]，如何保持農(nóng)產(chǎn)品的價值成為現(xiàn)實亟需解決的問題。近年來，為滿足人們不同人群口味的需求，焙烤行業(yè)迅猛發(fā)展，特別是中秋時節(jié)的特色月餅層出不窮，這引起了廣大消費者的青睞，從而為荔枝、龍眼、芒果的混果餡料的加工提供新思路。

復合益生菌發(fā)酵因其在增強風味、強化發(fā)酵性能、提高發(fā)酵效率等[5]方面有著重要的作用而備受青睞，相較于單菌發(fā)酵，經(jīng)多菌種協(xié)同發(fā)酵后，產(chǎn)品風味可以得到很大改善[6]。例如，賈瑞娟等[5]利用復合菌種發(fā)酵生產(chǎn)的陳醋，其產(chǎn)品的風味顯著提高。眾所周知，植物乳桿菌在風味發(fā)酵食品中起著重要的作用；DU-106是一種具有極高增殖能力的好氧型產(chǎn)乳酸芽孢桿菌，其基因組缺乏編碼致吐毒素合成酶、腸毒素FM和細胞毒素K的毒力基因，此外，Hoang等[7]也綜述了芽孢桿菌是比乳酸菌更耐pH、更廣譜的細菌素，可作為一種生物防腐劑。因此DU-106極具有成為食品工業(yè)中益生菌發(fā)酵劑和防腐劑的潛力。

試驗旨在利用植物乳桿菌復合DU-106發(fā)酵荔枝、龍眼、芒果的混果餡料并探究其營養(yǎng)成分變化和揮發(fā)性物質變化，為農(nóng)產(chǎn)品的深加工提供理論基礎，同時，對開發(fā)一款綠色健康的水果飲料有積極的推動作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

新鮮荔枝、芒果和龍眼，購于廣州市天河區(qū)五山超市；菌種選用乳酸芽孢桿菌DU-106以及植物乳桿菌，由華南農(nóng)業(yè)大學新資源與功能性原料研究及評價中心鑒定及保藏；乳酸標準品試劑（上海源葉生物科技有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設備

PHS-3C型PH計（上海精密科學儀器有限公司）；UV-1100型紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；DHP600型電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；QP2010 Ultra型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（日本島津公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料前處理

選用新鮮荔枝、龍眼和芒果去皮去核后，按照質量比3∶1∶2置入打漿機形成混合水果勻漿。將打好的混合水果漿液置于滅菌鍋中100 ℃蒸煮30 min，冷卻后接種復合菌種得到混果餡料，復合菌比例為植物乳桿菌∶乳酸芽孢桿菌DU-106=1∶1，接種量為混合果漿勻漿質量分數(shù)的0.1%，培養(yǎng)箱溫度設定參數(shù)為28 ℃，每隔24 h測定發(fā)酵液的營養(yǎng)成分及揮發(fā)性物質。

1.3.2 發(fā)酵混果餡料營養(yǎng)成分的測定

1.3.2.1 pH的測定

使用PHs-3C型pH計直接進行測定。

1.3.2.2 總酸的測定

參照GB/T 12456—2008[8]中酸堿滴定法測定混果餡料樣品的總酸含量（以乳酸計，g/kg）。

1.3.2.3 可溶性固形物的測定

利用糖度計測定其中的可溶性固形物含量。

1.3.2.4 還原糖的測定

參考GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》[9]進行測定。

1.3.2.5 乳酸的測定

乳酸的測定將參照GB 5009.157—2016[10]中有機酸測定方法進行。色譜條件：Amnex HPX-87H色譜柱；流動相選用濃度為0.1%的磷酸水溶液；流速400 μL/min；柱溫40 ℃；紫外檢測器波長210 nm；手動進樣量20 μL。

1.3.3 發(fā)酵混果餡料揮發(fā)性物質的測定

利用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術（GC-MS）測定混果餡料發(fā)酵前后的揮發(fā)性成分。

1.3.3.1 樣品前處理

參照雷冬明等[11]的方法，對混果餡料發(fā)酵液進行預處理。首先將固相微萃取針頭預先老化，將上述制得的混果餡料準確稱取4 g送入15 mL頂空瓶中，在40 ℃的條件下水浴加熱30 min，隨后將老化好的萃取針頭插入頂空瓶，頂空萃取在40 ℃恒溫的條件下進行30 min，隨后置入GC-MS進樣口處在250 ℃下解吸2 min。

1.3.3.2 色譜條件

色譜柱選用HP-5毛細管柱；揮發(fā)性物質升溫程序：選用不分流進樣模式，初始溫度40 ℃，柱溫40 ℃，保持3 min。然后以5 ℃/min的升溫速率使溫度升至150 ℃，保持1 min。最后以10 ℃/min的升溫速率使溫度升至230 ℃，保持1 min；載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min。

1.3.3.3 質譜條件

質譜調諧類型為EI模式，電子能量為70 ev；離子源溫度230 ℃，MS四極桿溫度150 ℃；接口溫度250 ℃；質量掃描范圍30～400 amu；溶劑延遲為1.00 min；EM設置為增益因子1.003。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

試驗樣品進行三次平行測定，利用圖譜檢索對應物質進行定性定量分析，使用GraphPad Prism 7作圖并分析數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵時間對混果餡料營養(yǎng)成分的影響

2.1.1 發(fā)酵時間對混果餡料pH的影響

由圖1可知，混果餡料的初始pH為4.5，發(fā)酵初期的混果餡料的pH隨著發(fā)酵時間的增加而逐步降低，主要是由于兩種產(chǎn)乳酸的菌種利用混果餡料中的乳糖發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，導致體系內的pH下降。在發(fā)酵中期至后期的pH趨于穩(wěn)定，發(fā)酵第7天pH為3.4，其原因一方面，可能是由于混果餡料發(fā)酵液中乳糖的含量減少，益生菌進入停滯生長狀態(tài)，導致乳酸產(chǎn)生量減少甚至停止產(chǎn)生乳酸[12-13]。另一方面是由于發(fā)酵產(chǎn)生乳酸使得H+濃度過高，抑制了菌種的生長，甚至導致菌種的自溶現(xiàn)象[14]。發(fā)酵液維持在一定的pH可以提高混果餡料的保藏性能，同時，適宜的pH還能增加混果餡料的風味和口感[6]。因此，發(fā)酵后的混果餡料其pH維持在3.4，能延長果漿的貨架期。

圖1 發(fā)酵時間對混果餡料pH的影響

2.1.2 發(fā)酵時間對混果餡料總酸和乳酸的影響

由圖2和圖3可知，混果餡料總酸和乳酸的含量隨著發(fā)酵時間的延長而在不斷上升，這是因為乳酸菌和乳酸芽孢桿菌不斷產(chǎn)酸的結果。發(fā)酵前混果餡料總酸含量0.97 g/kg，發(fā)酵1周后總酸的含量高達14.22 g/kg，發(fā)酵前乳酸的含量為1.1 mg/g，發(fā)酵一周后達到了15.0 mg/g，這與圖1中發(fā)酵體系中pH的下降相對應。乳酸含量的整體上升是總酸含量上升的關鍵因素，乳酸菌通過EMP途徑的主要代謝產(chǎn)物便是乳酸[15]。相關研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酸芽孢桿菌與乳桿菌復合發(fā)酵能夠刺激乳桿菌提高其產(chǎn)酸能力[16]；賈瑞娟等[5]利用芽孢菌和醋酸菌、乳酸菌發(fā)酵山西老陳醋結果表明芽孢菌能夠提高產(chǎn)品的風味。吳姍姍等[17]利用釀酒酵母171和乳酸芽孢桿菌DU-106發(fā)酵佛手果，結果表明隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵佛手果酒中pH和可溶性固形物的含量逐漸下降，感官評分增加，說明混菌發(fā)酵增強了香氣復雜性和層次感[18]。試驗研究結果表明混果餡料中乳酸含量提高，擁有良好口感和風味。

圖2 發(fā)酵時間對混果餡料總酸的影響

圖3 發(fā)酵時間對混果餡料乳酸的影響

2.1.3 發(fā)酵時間對混果餡料還原糖和可溶性固形物的影響

由圖4和圖5可知，混果餡料初始還原糖含量為5.63 g/100 g，隨著發(fā)酵時間的延長，還原糖含量逐步下降至發(fā)酵結束的4.95 g/100 g，可溶性固形物含量由發(fā)酵前的17.10%下降至發(fā)酵后的15.83%。這可能是因為還原糖是乳酸菌的發(fā)酵原料，供給乳酸菌繁殖和新陳代謝所需能量，故呈現(xiàn)下降趨勢，而發(fā)酵后還存在大量的還原糖和可溶性固形物，而且越到發(fā)酵后期，混果餡料中還原糖和可溶性固形物的含量趨于穩(wěn)定，可能是由于乳酸菌利用混果餡料中的乳糖而無法利用其他的糖類導致的，這與發(fā)酵后期pH的變化和總酸上升至趨于穩(wěn)定的結果相一致，這也可以說明發(fā)酵液中沒有感染其他的雜菌，發(fā)酵狀態(tài)良好。試驗結果表明，發(fā)酵后還原糖的含量并沒有急劇下降，說明其主要營養(yǎng)成分的變化不明顯，而且適當?shù)奶呛磕茉黾羽W料的甜度，平衡pH下降導致過酸。

圖4 發(fā)酵時間對混果餡料還原糖的影響

圖5 發(fā)酵時間對混果餡料可溶性固形物含量的影響

2.2 混果餡料發(fā)酵時間對混果餡料揮發(fā)性成分的影響

2.2.1 發(fā)酵時間對混果餡料揮發(fā)性物質變化的影響

試驗利用氣相色譜—質譜聯(lián)用技術（GC-MS）來對混果餡料樣品中的揮發(fā)性物質進行測定，分析結果見表1和圖6。未發(fā)酵前（發(fā)酵第0天）共檢測出27種揮發(fā)性物質，隨著發(fā)酵的進行，最多共產(chǎn)生47種揮發(fā)性物質，發(fā)酵最后1天共檢測到24種揮發(fā)性物質，可以看出發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質先增加后減少的趨勢，為了探究混果餡料中風味的變化，將揮發(fā)性物質進行歸類處理。

圖6 不同發(fā)酵時間混果餡料中揮發(fā)性物質氣相色譜圖

表1 發(fā)酵時間對混果餡料揮發(fā)性物質的影響

2.2.2 發(fā)酵時間對混果餡料揮發(fā)性物質種類的影響

如圖7（A）所示，隨著發(fā)酵進程的延長，醇類物質的變化呈波動的趨勢，但總體的含量略微下降，由發(fā)酵前的9.01%降低至發(fā)酵結束后的7.79%。發(fā)酵過程中檢測出芳樟醇、香茅醇、香葉醇等物質，芳樟醇作為全世界廣泛使用的香料，其帶有茶香，而香茅醇、香葉醇則帶有玫瑰和水果的香味，這些物質都賦予了混果餡料的特別氣味[19-20]。如圖7（B）所示，發(fā)酵后烯類物質是荔枝主要的揮發(fā)性成分，占比達到了27.58%，從發(fā)酵開始到發(fā)酵結束期間不斷產(chǎn)生新的烯類物質，而后又被降解。其中蒎烯、月桂烯、羅勒烯是混果餡料主要的烯類物質的來源，并賦予果漿濃郁的果香和松木氣味[21-22]。如圖7（C）所示，發(fā)酵過程中揮發(fā)性有機酸的含量上升，達到19.50%。圖7（D）顯示，揮發(fā)性烷類物質隨著發(fā)酵時間的延長而略微下降，烷烴類揮發(fā)性物質曾在甲殼類水產(chǎn)品中被檢出，由于它們的閾值較高，因而對其整體的風味貢獻不大[23]。圖7（E）顯示揮發(fā)性胺類物質隨著發(fā)酵時間的延長而下降。從圖7可以得出，發(fā)酵前后的混果餡料風味差異很大，以醋酸為主的揮發(fā)性有機酸含量上升，賦予混果餡料一定的酸味，胺類物質下降可以減輕混果餡料中令人不適的臭味?；旃W料中對風味貢獻最大的是醇類和烯類的揮發(fā)性物質，幾種揮發(fā)性物質共同作用構成了混果餡料特殊的風味[24]。

圖7 發(fā)酵時間對各類揮發(fā)性物質變化的影響

3 結論

試驗以荔枝、龍眼、芒果為原料制成的混果餡料經(jīng)過混菌發(fā)酵并測定其發(fā)酵過程的營養(yǎng)物質和揮發(fā)性物質的變化情況，在植物乳桿菌和DU-106菌種1∶1復合發(fā)酵過程中，混果餡料中pH下降，還原糖、可溶性固形物含量下降，乳酸和有機酸的含量上升；發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質的變化很大，烯類和有機酸類揮發(fā)性物質上升，胺類揮發(fā)性物質下降。醇類和烯類物質構成了混果餡料中主要的風味物質。試驗結果為開發(fā)新型的益生菌發(fā)酵工業(yè)提供了一定的理論基礎，為混菌發(fā)酵在食品工業(yè)中的應用提供數(shù)據(jù)支撐。