王展華，施 貝，張文萍，岳 超，柴妍熙

(1.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州 310052；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與信息工程學(xué)院，浙江杭州 310053)

花椒是我國傳統(tǒng)的香辛料，在我國西南地區(qū)的菜肴烹飪中占有舉足輕重的作用，其衍生產(chǎn)品在醫(yī)藥、農(nóng)藥、防蟲等方面具有重要的使用價值。近年來隨著四川重慶火鍋風(fēng)靡全國，花椒的產(chǎn)銷量呈遞增趨勢，預(yù)計到2025年，全國花椒的需求量將接近100萬t?；ń贩N植及相關(guān)產(chǎn)業(yè)規(guī)模逐年擴(kuò)大，但是對于可以花椒上登記使用的農(nóng)藥品種尚無明確規(guī)定，導(dǎo)致花椒產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留超標(biāo)的現(xiàn)象時有發(fā)生。

草甘膦屬于非選擇類除草劑，在使用后會發(fā)生降解，其主要降解產(chǎn)物是氨甲基膦酸，目前對于草甘膦項目的檢驗主要檢測草甘膦和氨甲基膦酸。隨著草甘膦在全球被廣泛大量應(yīng)用，草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸在環(huán)境及其生物體中富集，對人類的健康造成很大的威脅，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)于2015年3月20日判定，草甘膦具有遺傳毒性，它可以損壞DNA，對動物致癌。在日常監(jiān)測中由于草甘膦及其代謝物本身為強(qiáng)極性，且含膦酸基和氨基酸基兩性基團(tuán)，缺少發(fā)色和熒光基團(tuán)，無法直接使用紫外及熒光檢測器進(jìn)行檢測。草甘膦沸點(diǎn)為465.8 ℃，其代謝物氨甲基膦酸沸點(diǎn)為358.0 ℃，無法直接使用氣相色譜進(jìn)行檢測。目前用于草甘膦及其代謝物的檢測方法主要采用化學(xué)衍生的方法，通過降低沸點(diǎn)或增加發(fā)色熒光基團(tuán)來改善GC和HPLC的色譜行為，提高檢測響應(yīng)值。

目前我國頒布的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中對谷物、油料油脂等7類食品的草甘膦限量作出了具體的規(guī)定，限量標(biāo)準(zhǔn)0.05～7.00 mg/kg；但是其中調(diào)味料中僅對葉類調(diào)味料和胡椒作出了限量規(guī)定，對花椒沒有作出相應(yīng)的規(guī)定。在實(shí)際風(fēng)險監(jiān)測中參照調(diào)味料草甘膦推薦測定方法SN/T 1923和GB/T 23750對花椒中的草甘膦殘留量進(jìn)行監(jiān)測，由于2種方法均使用了CAX陽離子固相萃取柱進(jìn)行凈化，為傳統(tǒng)的吸附-洗脫模式，試驗發(fā)現(xiàn)，上述2種檢測標(biāo)準(zhǔn)中采用凈化淋洗液為水相，水相凈化液需使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，耗時較長，凈化操作過程中需要頻繁轉(zhuǎn)移，操作步驟較為煩瑣。筆者選取花椒為研究基質(zhì)，利用親水親脂固相萃取柱的特點(diǎn)，使用通過式固相萃取技術(shù)對目標(biāo)物的凈化，建立通過式固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定花椒中草甘膦及其代謝物(氨基甲酸膦酸)殘留的分析方法，以期為日常監(jiān)督抽檢中花椒中草甘膦及其代謝物快速檢測提供依據(jù)，同時對香辛料中草甘膦及其代謝物殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)制定和更新具有重要的借鑒意義。

1 材料與方法

Shimadzu LC-30AD超高效液相色譜儀(日本島津公司)；SCIEX Triple Quad5500+系統(tǒng)-QTRAPActivated質(zhì)譜儀(美國ABSciex公司)；Merck Milli-Q超純水儀(德國默克密理博公司)；Sorvall LYNX 6000 超速離心機(jī)(美國熱電公司)；XPE205分析天平(瑞士梅特勒公司)；MultiReax多通道旋渦混合器(德國Heidolph公司)；Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(美國waters公司)；Waters Oasis HLB (200 mg，6 mL) 固相萃取柱(美國沃特世公司)；0.22 μm有機(jī)濾膜(上海安譜實(shí)驗科技股份有限公司)。

甲醇(hypergrade for LC-MS，Merck KGaA)；乙腈(hypergrade for LC-MS，Merck KGaA)；丙酮(AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氯甲酸-9-芴基甲酯(衍生級，純度≥99.9%，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；草甘膦(純度≥99.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；氨甲基膦酸(純度≥99.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；1，2-CN草甘膦(純度≥99.8%，TRC Canada);二氯甲烷(AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；十水合四硼酸鈉(AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸二氫鉀(AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；花椒(采購于杭州聯(lián)華超市)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

草甘膦及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制。準(zhǔn)確稱取草甘膦和氨甲基膦酸各10.0 mg置于50 mL容量瓶中，用純水溶解后定容至刻度，得到濃度為200 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

草甘膦及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制。準(zhǔn)確量取草甘膦及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)儲備液50 μL置于10 mL容量瓶中，用純水至刻度，得到濃度為1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

同位素內(nèi)標(biāo)儲備溶液的配制。準(zhǔn)確稱取1 mg的1，2-CN草甘膦置于10 mL容量瓶中，用純水定容至10.0 mL得濃度為100 μg/mL同位素內(nèi)標(biāo)儲備溶液。

同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液的配制。取1 mL同位素內(nèi)標(biāo)儲備溶液于10 mL容量瓶中，用純水定容至10.0 mL得濃度為10 μg/mL同位素內(nèi)標(biāo)儲備溶液。

樣品前處理。準(zhǔn)確稱取粉碎后的花椒樣品2.0 g于50 mL 塑料離心管中，同時加入100 μL同位素內(nèi)標(biāo)儲備溶液(濃度為10 μg/mL)，靜置10 min，加入10 mL水，置于MultiReax多通道旋渦混合器上渦旋混合20 min，加入5 mL二氯甲烷，渦旋混合10 min，以5 000 r/min離心10 min，取水相于10 mL玻璃試管中作為待凈化液。取5 mL凈化液，使用Waters Oasis HLB(200 mg，6 mL)親水親脂固相萃取柱進(jìn)行凈化，棄去初始2 mL樣液，收集洗脫液，待衍生。取1 mL樣品洗脫液于10 mL具塞玻璃比色管中，加入200 μL 5%硼酸鹽緩沖溶液，渦旋混勻。加入200 μL 1.0 g/L 氯甲酸-9-芴基甲酯-丙酮溶液，渦旋混勻。在20 ℃下放置4 h，進(jìn)行衍生化反應(yīng)。衍生化溶液使用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備。分別量取草甘膦及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)中間液(1 mg/L)50、100、500、1 000、2 000、5 000 μL，置于10 mL容量瓶中，用純水定容至刻度，作為混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度分別為5、10、50、100、200、500 μg/L。移取標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各1.0 mL加入同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液(100 μg/mL)10 μL，按樣品衍生化方法進(jìn)行衍生化處理，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件。島津LC-30AD超高效液相色譜系統(tǒng)串聯(lián)Applied Biosystems Qtrap 5500三重四級桿質(zhì)譜儀，包括二元泵，在線脫氣，自動進(jìn)樣器；色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 (150 mm×2.1 mm，1.8 μm)；柱溫為35 ℃；流動相為0.1%甲酸混合水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈混合溶液(B)；梯度洗脫程序：0～2 min，10%B，2～5 min，10%～80%B，5～8 min，80%～10%B；流速0.35 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為TurboV 電噴霧(ESI)離子源；電離方式為正離子；霧化電壓(IS)5 500 V；離子源溫度(TEM)500 ℃；霧化氣壓力(GS1)344.7 kPa；輔助加熱氣壓力(GS2)344.7 kPa；碰撞室入口電壓(EP)10 V；碰撞室出口電壓(CXP)13 V；碰撞電壓(CE)、去簇電壓(DP)、定性離子對、定量離子對、化合物分子量見表1。

表1 質(zhì)譜條件Table 1 Mass spectrometry conditions

分離色譜柱的選擇。選擇Waters ACQUITY UPLC HSS T3(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Waters ACQUITY UPLC BEH-C色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)進(jìn)行分離試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱進(jìn)行分離時，草甘膦衍生物和氨甲基磷酸衍生物分離較好、峰型良好，響應(yīng)優(yōu)于Waters ACQUITY UPLC BEH-C色譜柱。主要原因是其C烷基鍵合相進(jìn)行了基端封尾，提升了極性化合物的保留，能夠更好分離2種物質(zhì)。

液相色譜條件的優(yōu)化。該研究采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱作為分離柱，比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水(0.1%甲酸)、乙腈-水(0.1%甲酸)4種流動相，結(jié)果表明，乙腈-水作為流動相時，由于乙腈的洗脫能力強(qiáng)于甲醇，對于草甘膦衍生物和氨甲基膦酸的分離度和靈敏度明顯優(yōu)于甲醇-水；在水相中添加0.1%甲酸可使草甘膦及其代謝物的衍生物預(yù)先在流動相中質(zhì)子化，提高離子化效率，從而提高檢測靈敏度。通過比較0.1%甲酸濃度對2種衍生物的影響，最終確定流動相為乙腈-水(0.1%甲酸)。在此流動相條件下各物質(zhì)均能很好地分離。進(jìn)一步對梯度洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化，目標(biāo)物分離度良好、保留時間適中，優(yōu)化后的多反應(yīng)監(jiān)測離子流色譜圖見圖1～3。

由于草甘膦和氨甲基膦酸衍生物均適合在ESI正離子模式下進(jìn)行檢測，使用500 μg/L的草甘膦和氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按方法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行衍生化處理后，在正離子模式掃描下，根據(jù)相應(yīng)物質(zhì)的分子量確定一級質(zhì)譜的掃描范圍，分別進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描找到母離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描確定出2～3個相應(yīng)比較高的子離子，最后通過多反應(yīng)檢測掃描優(yōu)化相應(yīng)質(zhì)譜參數(shù)。優(yōu)化結(jié)果見表1。

圖1 1,2-14C215N草甘膦衍生物多反應(yīng)監(jiān)測離子流色譜圖Fig.1 Multiple reaction monitoring ion chromatogram of 1,2-14C215N glyphosate-FMOC

圖 2 草甘膦衍生物多反應(yīng)監(jiān)測離子流色譜圖Fig.2 Multiple reaction monitoring ion chromatogram of glyphosate-FMOC

圖3 氨甲基膦酸衍生物多反應(yīng)監(jiān)測離子流色譜圖Fig.3 Multiple reaction monitoring ion chromatogram of aminomethyl phosphonic-FMOC

提取條件的優(yōu)化。草甘膦及其代謝物溶于水，不溶于一般的有機(jī)溶劑，目前的國家標(biāo)準(zhǔn)和相應(yīng)研究中均使用水提取溶劑?；ń窐悠分泻腥啤㈢薮?、酰胺、生物堿等化合物，其揮發(fā)油含量大于0.025 mL/g。這些大分子物質(zhì)進(jìn)行液相質(zhì)譜分析時在對色譜柱和離子源產(chǎn)生污染的同時，產(chǎn)生較為嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)，對該研究試驗結(jié)果產(chǎn)生較大影響。在實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)使用純水提取的樣品提取液，顏色較深，呈渾濁狀態(tài)，衍生化上機(jī)后，離子化效率過低，定量限難以滿足日常檢驗要求。該研究對純水提取的提取液，使用5 mL二氯甲烷通過液液萃取的方式進(jìn)行除脂，有效地降低了雜質(zhì)過多而產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)。

固相萃取柱的選擇和優(yōu)化。香辛料中草甘膦測定方法SN/T 1923和GB/T 23750均使用了CAX陽離子固相萃取柱進(jìn)行凈化，日常監(jiān)測試驗發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)物洗脫時由于洗脫液中主要為水相從而導(dǎo)致濃縮時間較長、步驟復(fù)雜煩瑣。在該研究，根據(jù)草甘膦及氨甲基膦酸強(qiáng)極性的特點(diǎn)，采用了Waters Oasis HLB固相萃取柱對花椒的水提取溶液進(jìn)行凈化。

取濃度50和200 μg/L的草甘膦及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按樣品前處理方法使用Waters Oasis HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化，草甘膦及其代謝物的回收率在93.1%～98.2%，結(jié)果表明采用Waters Oasis HLB固相萃取柱進(jìn)行通過式凈化，固相萃取柱未吸附待測物質(zhì)，可以用于草甘膦及其代謝物檢測的凈化。

衍生條件的選擇。SN/T 1923中規(guī)定使用氯甲酸-9-芴基甲酯丙酮溶液衍生需要在室溫下放置過夜，使試驗時間過長，在該研究中將衍生過程放置于在25 ℃恒溫振蕩器中，取濃度為100 mg/L的草甘膦及氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液100 μL，用水定容至10 mL的1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)中間液，添加過量衍生試劑條件下，50 r/min進(jìn)行恒溫振蕩衍生2～8 h，每隔1 h 上機(jī)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)衍生4 h后，測得值與衍生過夜測得值相比無明顯變化，說明在衍生4 h后，衍生基本完全。此次研究確定草甘膦及其代謝物衍生時間為4 h。

方法的檢出限、定量限和線性范圍。采用混合標(biāo)準(zhǔn)中間液配制成5～500 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明, 草甘膦及其代謝物衍生物在5～500 μg/L線性關(guān)系良好(>0.99)。

在2 g花椒空白基質(zhì)樣品中加入10 μL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(1 000 μg/L)，理論加標(biāo)濃度為5.0 μg/kg，按照已建立方法檢測，信噪比>3為檢出限，結(jié)果表明加標(biāo)濃度為5.0 μg/kg時，草甘膦和氨甲基膦酸的信噪比均大于100，滿足檢出限信噪比>3的要求，該方法的檢出限低于SN/T 1932規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)(50.0 μg/kg)要求，可滿足日常監(jiān)督檢測的需求。

表2 草甘膦和氨甲基膦酸的線性方程、決定系數(shù)、檢出限Table 2 Linear equations, determination coefficients and detection limits of glyphosate and aminomethyl phosphonic acid

方法的回收率和精密度。分別選取了5、50和200 μg/kg 3個濃度梯度水平對空白樣品進(jìn)行加標(biāo)試驗，每個濃度水平測定6次，計算加標(biāo)回收率和RSD值，檢驗結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，草甘膦及氨甲基膦酸的回收率分別為87.4%～96.4%、88.7%～97.1%，RSD分別為3.3%～4.2%、2.5%～4.1%，表明該方法穩(wěn)定、可靠。

表3 草甘膦和氨甲基膦酸的加標(biāo)回收率及其RSD(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSD of glyphosate and aminomethyl phosphonic acid

應(yīng)用該方法分析了市場上采購的10份花椒樣品，其中1批次樣品花椒樣品有氨甲基膦酸檢出，檢出值為20.7 μg/kg。實(shí)際樣品檢測結(jié)果與SN/T 1923 測得結(jié)果相比沒有明顯差異，說明該方法能夠替代SN/T 1923用于草甘膦及其代謝物的日常檢測。

3 小結(jié)

該研究建立了通過式固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定花椒中草甘膦及代謝物殘留的檢測方法，方法對提取液采用通過式固相萃取的凈化方式，其凈化方案與國標(biāo)及其他文獻(xiàn)中吸附-洗脫模式相比較，具有操作簡便、步驟簡單的特點(diǎn)。研究結(jié)果表明，與目前的國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)相比，該方法檢出限更低，定量結(jié)果更為準(zhǔn)確，分析總耗時更短，為花椒及其他香辛料中草甘膦和氨甲基膦酸殘留檢測提供更加準(zhǔn)確可靠的定性篩查和定量分析方法，也為香辛料的食品安全監(jiān)管及質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。