周秀錦，江曉瓊，邵宏宏，張 靜，冷向陽，楊會(huì)成 (.舟山海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，浙江舟山 60；.舟山市科學(xué)技術(shù)局，浙江舟山 60；.上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司，上海 005；.浙江海洋開發(fā)研究院，浙江舟山 60)

黑鯛()因具有廣溫、廣鹽性、抗逆性強(qiáng)、生長迅速、肉質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)而成為我國東南沿海地區(qū)及太平洋西岸海水養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)魚類。隨著海洋經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，黑鯛養(yǎng)殖集約化程度越來越高，海水中病原菌種類越來越多，黑鯛的發(fā)病率也越來越高。具有噬鹽性的副溶血弧菌()廣泛附著在海產(chǎn)品表面，是魚類弧菌病中危害最大的病原菌之一，是海水養(yǎng)殖黑鯛的主要危害因子。目前已有利用添加免疫增強(qiáng)劑的飼料飼喂海水魚類來防治疾病的文獻(xiàn)報(bào)道。硒是海魚機(jī)體必需的微量元素之一，它參與體內(nèi)一些決定性的新陳代謝。通過化學(xué)修飾方法將多糖與無機(jī)硒結(jié)合，獲得硒化氨基多糖。硒化氨基多糖的生物活性普遍高于硒和多糖，更易于吸收和利用。目前已有關(guān)于硒化氨基多糖作為增強(qiáng)適應(yīng)性免疫性能潛力的含硒膳食補(bǔ)充劑的報(bào)道。目前關(guān)于外源硒可以提高黑鯛幼魚的生長性能和血清免疫活性的相關(guān)文獻(xiàn)，但關(guān)于硒化氨基多糖對(duì)黑鯛免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究報(bào)道較少。

代謝組學(xué)是以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)、以高通量檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理為手段、以信息建模與系統(tǒng)整合為目標(biāo)的系統(tǒng)生物學(xué)，可以直接反映機(jī)體內(nèi)生物化學(xué)過程和狀態(tài)的變化，在系統(tǒng)研究生物內(nèi)源性小分子代謝物的整體和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律上具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。目前代謝組學(xué)分析技術(shù)應(yīng)用比較廣泛的主要有核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技術(shù)和高分辨質(zhì)譜(high-resolution mass spectrometers,HRMS)技術(shù)2種。NMR技術(shù)因具有不損失檢測(cè)樣品且重復(fù)性良好等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)中，檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低、不能完全反映代謝組學(xué)中的變化是該技術(shù)的主要缺點(diǎn)。HRMS技術(shù)與色譜聯(lián)用可獲得目標(biāo)化合物的相對(duì)分子量及結(jié)構(gòu)信息，已成為代謝組學(xué)研究的主要技術(shù)手段。筆者采用高通量、高靈敏度、高分辨率的UPLC-QTOF-MS技術(shù)，結(jié)合非靶向代謝組學(xué)方法，研究硒化氨基多糖調(diào)節(jié)攻毒后黑鯛免疫力的潛在機(jī)制和靶標(biāo)途徑，旨在為黑鯛免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

低聚氨基多糖 (low molecular aminopolysaccharide,LA)分子量約50 ku；自制硒化低聚氨基多糖，其中硒有效含量為27.3 mg/g。黑鯛幼魚由浙江省海洋水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)場(chǎng)提供，分組前停飼1 d，將初始體重(13.00±0.20)g的健康黑鯛幼魚隨機(jī)分成2組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25尾，放入容積310 L(水體積260 L)的玻璃纖維缸內(nèi)微流水式飼養(yǎng)。試驗(yàn)組飼喂添加0.6 mg Se/kg硒化氨基多糖的飼料，對(duì)照組飼喂未添加硒化氨基多糖的飼料，試驗(yàn)期為8 w，飼喂試驗(yàn)結(jié)束后停飼，黑鯛腹腔注射0.2 mL副溶血弧菌活菌液(副溶血弧菌在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃下過夜培養(yǎng)，然后用滅菌生理鹽水洗脫，稀釋到試驗(yàn)所需菌液濃度5.5×10CFU/mL時(shí)攻毒，觀察黑鯛的健康狀況并統(tǒng)計(jì)死亡率。對(duì)照組黑鯛脾臟分別在饑餓48和96 h時(shí)，使用MS-222(間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽60 mg/L，色譜純，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品)麻醉后摘??；試驗(yàn)組在攻毒試驗(yàn)48和96 h時(shí)摘取黑鯛脾臟組織，每組10個(gè)平行樣，稱重后液氮快速冷凍，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，備用。

參考該課題組前期研究所用代謝組學(xué)分析方法進(jìn)行黑鯛脾臟樣品前處理、液相色譜分離、黑鯛脾臟樣品中的內(nèi)源性代謝物檢測(cè)。利用XCMS結(jié)合上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司(SCIEX)獨(dú)有的內(nèi)源性代謝物二級(jí)譜庫(Metabolite HR MSlibrary，該譜庫包含代謝物的分子式、分子量、CAS碼、結(jié)構(gòu)式、一級(jí)質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜等信息)對(duì)質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行全面的非靶向代謝組學(xué)分析。采用XCMS軟件進(jìn)行內(nèi)源性代謝物的主成分分析(principal component analysis,PCA)，使用MetaboAnalyst 4.0 網(wǎng)站軟件在線進(jìn)行代謝通路分析。

2 結(jié)果與分析

黑鯛在攻毒48和96 h時(shí)均未發(fā)生死亡現(xiàn)象，個(gè)別魚體在攻毒72 h時(shí)表現(xiàn)出攝食能力降低、游動(dòng)相對(duì)緩慢，其他臨床癥狀均不明顯。在快速分析試驗(yàn)中，采用UPLC分析系統(tǒng)可以獲得較高的重現(xiàn)性和分離效果。該試驗(yàn)中醋酸銨和醋酸組合的流動(dòng)相為大分子代謝物和小分子代謝物提供了最佳的色譜條件。采用2種不同性質(zhì)的色譜柱對(duì)脾臟樣品進(jìn)行分離：極性小的小分子代謝物在T色譜柱上呈現(xiàn)較好的分離，極性大的小分子代謝物則在HILLIC色譜柱上分離效果最好；在正、負(fù)離子模式下對(duì)對(duì)照組、試驗(yàn)組攻毒48和96 h時(shí)的脾臟樣本進(jìn)行QTOF-MS/MS分析和數(shù)據(jù)采集。圖1為各組樣品典型的總離子流色譜圖(total ion chromatograms,TIC)。由圖1可知，對(duì)照組攻毒48和96 h時(shí)黑鯛脾臟的指紋圖譜存在一定的差異，表明試驗(yàn)組黑鯛脾臟的內(nèi)源性代謝物主要組分有明顯變化。

注：A.HILLIC、負(fù)離子模式；B.HILLIC、正離子模式；C.T3、負(fù)離子模式；D.T3、正離子模式；a.對(duì)照組；b.攻毒48 h；c.攻毒96 h Note：A.HILLLIC，ESI-;B.HILIC，ESI+;C.T3，ESI-;D.T3，ESI+；a.Control group;b.Virus challenge after 48 h；b.Virus challenge after 96 h圖1 不同采集模式下各組樣品典型色譜圖樣品TIC圖譜Fig.1 Typical TIC patterns of each group of samples under different acquisition modes

為了考察飼喂硒化氨基多糖后副溶血弧菌活菌液攻毒后黑鯛脾臟代謝物的變化，使用XCMS軟件分析在正、負(fù)離子模式下采集的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，采取主成分分析(PCA)方法自動(dòng)進(jìn)行PCA輪廓分析。黑鯛脾臟代謝PCA輪廓分析結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，試驗(yàn)組攻毒48和96 h后，與對(duì)照組相比，在正、負(fù)離子模式下經(jīng)HILLIC色譜柱和T色譜柱分離的脾臟代謝物主成分均有明顯的分離趨勢(shì)，無交叉和重疊現(xiàn)象，表明試驗(yàn)組在副溶血弧菌攻毒后黑鯛脾臟代謝產(chǎn)物指紋圖譜均發(fā)生了顯著變化。

潛在生物標(biāo)志物的鑒定方法為試樣經(jīng)色譜柱分離后被離子化為不同質(zhì)量的離子，進(jìn)入質(zhì)譜質(zhì)量分析器，形成賴以定性的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜信息，通過一級(jí)質(zhì)譜信息可以確定相對(duì)分子量，利用二級(jí)質(zhì)譜信息可以獲得其結(jié)構(gòu)碎片信息。將經(jīng)T色譜柱和HILLIC色譜柱分離，在正、負(fù)離子模式下的高分辨質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，經(jīng)檢索Metabolite HR MSlibrary數(shù)據(jù)庫(SCIEX)發(fā)現(xiàn)，飼喂硒化氨基多糖的試驗(yàn)組攻毒48 h時(shí)共準(zhǔn)確鑒定出31個(gè)有顯著差異的潛在生物標(biāo)志物，與對(duì)照組相比除甜菜堿水平升高外，30種潛在生物標(biāo)志物水平呈現(xiàn)明顯的降低趨勢(shì)；攻毒96 h時(shí)共準(zhǔn)確鑒定出36個(gè)有顯著差異的潛在生物標(biāo)志物，與攻毒48 h時(shí)相比，除了L-精氨酸和鳥氨酸水平升高外，其他34種潛在生物標(biāo)志物水平均呈明顯下降趨勢(shì)；在整個(gè)試驗(yàn)過程中，4-胍基丁酸和α-亞麻酸呈現(xiàn)先上升(攻毒48 h)后下降(攻毒96 h)的趨勢(shì)。這表明硒化氨基多糖對(duì)黑鯛脾臟具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。具體結(jié)果見表1。

注：A.T3、負(fù)離子模式；B.T3、正離子模式；C.HILLIC、負(fù)離子模式；D.HILLIC、正離子模式；紅色表示攻毒48 h；藍(lán)色表示攻毒96 h；綠色表示對(duì)照組 Note：A.T3，ESI-;B.T3，ESI+;C.HILLIC，ESI-;D.HILLIC，ESI+;The red represent virus challenge after 48 h；The blue represent virus challenge after 96 h;The green represent the control group圖2 不同采集模式下脾臟代謝分析的PCA輪廓分析Fig.2 PCA profile analysis of spleen metabolic analysis under different acquisition models

表1 非靶向代謝組學(xué)分析的差異代謝物

接下表 續(xù)表1

根據(jù)Metabolite HR MSlibrary數(shù)據(jù)庫檢索得出的潛在生物標(biāo)志物，錄入MetaboAnalyst 4.0網(wǎng)站，以魚為分析模型，進(jìn)行相關(guān)代謝通路分析。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌攻毒48 h時(shí)，黑鯛脾臟代謝物中有顯著差異的31種潛在生物標(biāo)志物主要指向8條代謝通路(<0.05)；攻毒96 h時(shí)，黑鯛脾臟代謝物中有顯著差異的36種潛在生物標(biāo)志物主要指向10條代謝通路(<0.05)，主要涵蓋纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，氨酰轉(zhuǎn)移核糖核酸合成、嘌呤代謝等，具體見表2～3。

脾臟是魚類的造血組織和重要的外周免疫器官，在其發(fā)揮免疫作用的過程中其內(nèi)源性代謝物也發(fā)生相應(yīng)變化。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，黑鯛脾臟組織在副溶血弧菌攻毒48和96 h時(shí)可鑒定出的代謝物種類和代謝模式明顯不同，揭示了其內(nèi)源性代謝物的種數(shù)呈現(xiàn)明顯的動(dòng)態(tài)變化。內(nèi)源性代謝物中氨基酸是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)物質(zhì)，與免疫系統(tǒng)的組織發(fā)生、器官發(fā)育以及功能發(fā)揮起著重要的作用。該研究試驗(yàn)組黑鯛脾臟中脯氨酸、谷氨酸、賴氨酸等多種氨基酸的含量明顯低于對(duì)照組，表明硒化氨基多糖促進(jìn)了黑鯛機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)和氨基酸代謝；代謝通路分析結(jié)果證實(shí)14種氨基酸參與了機(jī)體免疫，其中谷氨酸和谷氨酰胺在攻毒48 h時(shí)參與氨基?；D(zhuǎn)移核糖核酸生物合成、嘧啶代謝和嘌呤代謝3條主要代謝通路，在攻毒96 h時(shí)參與氨基?；D(zhuǎn)移核糖核酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝和組氨酸代謝等5條主要代謝通路。機(jī)體內(nèi)谷氨酸可能是對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫均有一定抑制作用的潛在抑制劑。谷氨酸的前體是谷氨酰胺，谷氨酰胺通過減少HO的積累、保護(hù)DNA免受損害而發(fā)揮著重要的抗氧化作用，同時(shí)促進(jìn)了巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的有絲分裂和分化增殖，增加了機(jī)體炎癥因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)了免疫功能，攻毒后谷氨酸和谷氨酰胺水平呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，提示可能是因?yàn)槲被嗵菂⑴c了調(diào)節(jié)脾臟免疫反應(yīng)；纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸屬于機(jī)體必需氨基酸中的支鏈氨基酸(BCAAs)，其含量占動(dòng)物肌肉蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量的35%，具有蛋白質(zhì)合成、能量產(chǎn)生、神經(jīng)傳遞和免疫功能。該研究中試驗(yàn)組脾臟樣品中的BCAAs水平在攻毒后均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，表明BCAAs通過線粒體的支鏈氨基轉(zhuǎn)移酶被分解代謝為乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A，然后進(jìn)入三羧酸循環(huán)[其中亮氨酸產(chǎn)生乙酰輔酶A(CoA)及乙酰乙酰CoA、纈氨酸產(chǎn)生琥珀酸單酰CoA、異亮氨酸產(chǎn)生乙酰CoA及琥珀酸單酰CoA]，參與機(jī)體能量代謝來促進(jìn)乳酸-葡萄糖的循環(huán)和通過促進(jìn)糖異生保持體內(nèi)能量平衡，減少乳酸的累積，抑制腦內(nèi)5-羥色胺的合成，起到緩解肌肉酸痛和延緩疲勞發(fā)生發(fā)展的效果。該研究黑鯛脾臟內(nèi)多種氨基酸水平的變化現(xiàn)象表明了硒化氨基多糖對(duì)黑鯛脾臟的免疫增強(qiáng)調(diào)節(jié)功能與氨基酸代謝有密切關(guān)系。

甜菜堿具有活性甲基，作為一種直接有效的甲基供體，DNA、RNA、蛋白質(zhì)和許多其他重要的含甲基(CH)代謝化合物都需要甲基基團(tuán)。對(duì)甲基群代謝和調(diào)控的研究表明，甲基供體、代謝與疾病之間存在著顯著的相關(guān)關(guān)系；同時(shí)，甜菜堿可以增強(qiáng)細(xì)胞的保水能力，可能是通過控制細(xì)胞體積、穩(wěn)定蛋白質(zhì)和維持細(xì)胞膜完整性，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)酶免受滲透或溫度引起的滅活。已有文獻(xiàn)報(bào)道甜菜堿能降低炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)，具有降低炎癥相關(guān)疾病發(fā)生率的潛力。它們?cè)诿庖叻磻?yīng)中的重要性可能是由于其在免疫識(shí)別和抗體產(chǎn)生過程中發(fā)生DNA甲基化，也能改善魚類紅細(xì)胞生成、血清蛋白質(zhì)和脂肪水平、抗氧化狀態(tài)、免疫功能、神經(jīng)傳遞。脾臟內(nèi)代謝物甜菜堿水平在攻毒48 h時(shí)呈相對(duì)上調(diào)趨勢(shì)，96 h時(shí)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，提示硒化氨基多糖可能干預(yù)了脾臟甲基循環(huán)的生化通路，從而增強(qiáng)了黑鯛脾臟的抗病力。

表2 MetPA分析攻毒48 h后的代謝通路分析結(jié)果 Table 2 The analysis results of metabolic pathways after virus challenge 48 h by MetPA

表3 MetPA分析攻毒96 h后的代謝通路分析結(jié)果 Table 3 The analysis results of metabolic pathways after virus challenge 96 h by MetPA

精氨酸和脯氨酸可轉(zhuǎn)化為鳥氨酸，鳥氨酸攻毒96 h的水平相對(duì)上調(diào)，其原因可能是副溶血弧菌攻毒后黑鯛機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)分解加速，鳥氨酸含量上升，通過鳥氨酸循環(huán)的轉(zhuǎn)氨基作用，將毒性較高的-NH轉(zhuǎn)化為低毒的尿素排出體外，同時(shí)鳥氨酸參與了谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸的生物合成，從而增強(qiáng)黑鯛脾臟的免疫力。在核苷酸代謝過程中，嘧啶、嘌呤等堿基成分對(duì)單胺氧化酶的活性具有抑制作用，能夠提高活性氧自由基的清除能力，增強(qiáng)小鼠的抗氧化作用。該研究中試驗(yàn)組黑鯛脾臟中嘧啶、嘌呤在攻毒后均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說明黑鯛體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)減弱。

3 結(jié)論

該研究采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)在副溶血弧菌活菌液攻毒后對(duì)飼喂硒化氨基多糖的黑鯛脾臟進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。分別采用T和HILLIC 2種色譜柱分離結(jié)合XCMS方法進(jìn)行分析，攻毒96 h時(shí)篩選出36個(gè)有顯著差異的潛在生物標(biāo)志物，經(jīng)MetaboAnalyst 4.0網(wǎng)站軟件分析，飼喂硒化氨基多糖對(duì)黑鯛脾臟的10個(gè)代謝通路產(chǎn)生了影響。該研究結(jié)果表明硒化氨基多糖發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用與氨基酸代謝存在密切的關(guān)系，為今后深入探討硒化氨基多糖的免疫增強(qiáng)機(jī)制和合理開發(fā)免疫增強(qiáng)劑奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。