杜壯文， 歐陽(yáng)帆， 曾繁寬

(海南省瓊海市人民醫(yī)院, 海南 瓊海 571400)

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是一種常見(jiàn)的原發(fā)、高度惡化的骨惡性腫瘤，好發(fā)于青少年及兒童，局限性O(shè)S患者5年生存率為70%，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者5年生存率不到20%[1]。盡管OS臨床治療手段不斷改進(jìn)，但是術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率較高，生存狀況仍不容樂(lè)觀(guān)。微小RNA(micro RNA，miRNA)具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、凋亡等作用，參與惡性腫瘤發(fā)病過(guò)程，其中多種miRNA已被證實(shí)參與骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展。miR-650在不同的腫瘤中表現(xiàn)出不同的調(diào)控作用，在膠質(zhì)瘤中miR-650表達(dá)下調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-650后細(xì)胞增殖活性明顯下降，miR-650缺乏可上調(diào)FAM83F表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[2]。在非小細(xì)胞肺癌中miR-650表達(dá)上調(diào)，miR-650通過(guò)靶向生長(zhǎng)抑制因子4(ING4)，調(diào)控Wnt-1/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和侵襲[3]。目前miR-650與OS臨床病理參數(shù)和預(yù)后暫無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，鑒于此，本研究針對(duì)miR-650在OS的表達(dá)特點(diǎn)，分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象:選擇2016年1月至2018年12月瓊海市人民醫(yī)收治的80例OS患者，其中男52例，女28例，年齡9～17(13.26±3.19)歲，腫瘤部位：股骨遠(yuǎn)端27例，脛骨近端28例，肱骨近端21例，其他4例。腫瘤直徑2～7(5.19±2.35)cm，Enneking分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期41例，Ⅲ期15例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移19例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均行外科保肢手術(shù)治療，術(shù)后病理組織學(xué)診斷為OS；②患者均首次入院糾正，術(shù)前未接受放化療等其他免疫靶向治療；③臨床基線(xiàn)資料、病理資料及隨訪(fǎng)數(shù)據(jù)完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①脂肪肉瘤，纖維肉瘤，或合并其他部位原發(fā)腫瘤；②慢性化膿性骨髓炎，骨折、骨結(jié)核；③中斷隨訪(fǎng)者?；颊呒捌浼覍倬橥夂炇鹜鈺?shū)。

1.2miR-650表達(dá)檢測(cè):取手術(shù)切除瘤組織及瘤旁組織(距腫瘤組織邊緣≥5cm)標(biāo)本，組織研磨儀研磨后加入裂解液混勻，TRIzol試劑(美國(guó)Ambio公司)提取總RNA，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Epicentre公司)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取2μL cDNA樣品，CFX96實(shí)時(shí)熒光PCR儀(美國(guó)Bio-Rad)做3次平行試驗(yàn)，以GAPDH RNA為內(nèi)參，2-ΔΔCt計(jì)算miR-650相對(duì)表達(dá)量miR-650表達(dá)，取3次試驗(yàn)平均值。引物合成及序列測(cè)定由上海基康公司完成。見(jiàn)表1。

表1 引物序列反應(yīng)條件和體系

1.3隨訪(fǎng):所有患者均定期接受電話(huà)隨訪(fǎng)3年，統(tǒng)計(jì)隨訪(fǎng)期間生存情況，生存期定義為接受手術(shù)日期到全因死亡或隨訪(fǎng)結(jié)束時(shí)間。

2 結(jié) 果

2.1骨肉瘤、瘤旁組織miR-650表達(dá)比較:骨肉瘤組織與瘤旁組織miR-650相對(duì)表達(dá)量分別為5.03±1.19、1.02±0.36，骨肉瘤組織miR-650相對(duì)表達(dá)量明顯高于瘤旁組織(t=28.849，P<0.001)。

2.2miR-650表達(dá)與骨肉瘤患者病理參數(shù)的關(guān)系:miR-650表達(dá)Enneking分期 Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.001)，見(jiàn)表2。

表2 miR-650表達(dá)與骨肉瘤患者病理參數(shù)的關(guān)系

2.3生存分析:隨訪(fǎng)期間死亡36例，制作生存曲線(xiàn)(見(jiàn)圖1)，經(jīng)Log Rank檢驗(yàn)miR-650高表達(dá)組(miR-650≥5.03，42例)OS患者3年生存率為40.48%(17/42)，低于miR-650低表達(dá)組(miR-650<5.03，38例)的71.05%(27/38)(Log Rank 2=7.103，P=0.008)。

2.4COX回歸分析:以O(shè)S患者預(yù)后為因變量(1=死亡，0=存活)，年齡(賦值：連續(xù)性變量)、性別(賦值：0=男，1=女)、腫瘤部位(賦值：0=其它，1=骨遠(yuǎn)端，脛骨近端，肱骨近端)、腫瘤直徑(賦值：0=<5cm，1=≥5cm)、Enneking分期(賦值：0=Ⅰ、Ⅱ期，1=Ⅲ期)、淋巴轉(zhuǎn)移(賦值：0=否，1=是)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(賦值：0=否，1=是)、miR-650(賦值：0=miR-650<5.03，1=miR-650≥5.03)。分別采用單因素和多因素COX風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析影響OS患者預(yù)后的因素，最終結(jié)果顯示淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、miR-650≥5.03是OS患者死亡的危險(xiǎn)因素(P<0.01)，見(jiàn)表3、4。

表3 影響OS患者預(yù)后的單因素COX回歸分析

表4 影響OS患者預(yù)后的多因素COX回歸分析

圖1 OS患者術(shù)后3年生存曲線(xiàn)

3 討 論

OS是威脅青少年健康和生命安全的常見(jiàn)骨原發(fā)惡性腫瘤，以早期肺轉(zhuǎn)移和低生存率為特征。目前OS發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，缺乏有效的治療手段，即便接受手術(shù)和(或)化療患者預(yù)后依然較差，因此尋找OS診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物和靶點(diǎn)十分重要。

miRNA是一類(lèi)由20-25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，具有翻譯、基因調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等作用，通過(guò)降解或抑制信使RNA參與惡性腫瘤細(xì)胞增殖分化和凋亡過(guò)程。越來(lái)越多研究表明miRNA在OS發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，其中miR-188-5p通過(guò)靶向降解CCNT2抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力[4]，miR-98-5p通過(guò)下調(diào)細(xì)胞分裂周期25調(diào)控細(xì)胞周期抑制骨肉瘤惡性增殖和進(jìn)展[5]。miR-650最早被發(fā)現(xiàn)于人類(lèi)結(jié)直腸中，通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞活性，在不同的腫瘤中表現(xiàn)出不同的調(diào)控作用?，F(xiàn)有報(bào)道顯示miR-650在肝細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)靶向腫瘤抑制蛋白激酶2(LATS2)參與癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[6]。慢性淋巴細(xì)胞白血病患者miR-650也呈高表達(dá)，且與Binet分期、IGHV、P53基因畸變有關(guān)，miR-650通過(guò)調(diào)控腫瘤抑制基因NDRG2抑制細(xì)胞凋亡[7]。而在結(jié)腸癌中miR-650表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲作用，miR-650可能通過(guò)靶向AKT2蛋白抑制AKT通路誘導(dǎo)上皮型鈣黏附素(E-cadherin)表達(dá)，抑制細(xì)胞遷移和侵襲[8]。

然而miR-650與OS臨床病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)報(bào)道十分少見(jiàn)，本研究發(fā)現(xiàn)miR-650在骨肉瘤組織中高表達(dá)，提示miR-650在OS中可能發(fā)揮促癌基因作用。通過(guò)分析miR-650與臨床病理參數(shù)關(guān)系發(fā)現(xiàn)miR-650表達(dá)與OS患者Enneking分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-650過(guò)表達(dá)可能誘導(dǎo)OS細(xì)胞惡性增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，miR-650參與OS病情惡性進(jìn)展過(guò)程。推測(cè)miR-650參與OS的發(fā)病機(jī)制為：①miR-650通過(guò)下調(diào)靶基因ING4表達(dá)參與腫瘤炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)，ING4作為一種腫瘤抑制蛋白，其表達(dá)受抑制后可通過(guò)調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)活性誘導(dǎo)白細(xì)胞介素6(IL-6)的轉(zhuǎn)錄和分泌，IL-6促進(jìn)細(xì)胞間黏附分子-1表達(dá)，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化參與OS發(fā)病過(guò)程，因此miR-650可能通過(guò)ING4/NF-κB/IL-6軸參與OS發(fā)病機(jī)制[9]。②miR-650過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制ING4表達(dá)促使OS細(xì)胞快速增殖[10]。③miR-650與ADP-核糖基化因子-1(ARF1)mRNA靶向結(jié)合，ARF具有調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑、質(zhì)膜重組和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程[11]，是囊泡運(yùn)輸過(guò)程中通過(guò)分泌通路早期區(qū)隔的關(guān)鍵分子開(kāi)關(guān)[12]，參與侵襲性乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程以及OS破骨細(xì)胞分化過(guò)程和OS腫瘤微環(huán)境改變過(guò)程[13]，因此推測(cè)miR-650可能通過(guò)調(diào)控ARF1表達(dá)促進(jìn)OS細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)OS瘤細(xì)胞增殖，Enneking分期增加以及淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。通過(guò)隨訪(fǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，miR-650高表達(dá)與OS患者低生存率有關(guān)，COX風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析示miR-650高表達(dá)是OS患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，可能與miR-650高表達(dá)促使OS細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-650可以作為判斷OS患者預(yù)后情況的一項(xiàng)指標(biāo)。miR-650在人體組織中表達(dá)穩(wěn)定，卻對(duì)基因表達(dá)和調(diào)控具有關(guān)鍵作用，與骨肉瘤其它腫瘤標(biāo)志物比較，可更敏感地反映腫瘤發(fā)生和進(jìn)展，是骨肉瘤頗具前景的生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，骨肉瘤組織中miR-650呈高表達(dá)，miR-650表達(dá)與OS患者Enneking分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，miR-650高表達(dá)是OS預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。miR-650有望作為OS預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在標(biāo)志物和治療的潛在靶點(diǎn)。