夏 非， 張海平

(南通大學第二附屬醫(yī)院/江蘇省南通市第一人民醫(yī)院骨科， 江蘇 南通 226000)

骨肉瘤是常見的青少年和兒童骨惡性腫瘤，約占青少年惡性腫瘤的50%，惡性程度高，易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)移，尤其是肺部轉(zhuǎn)移，嚴重威脅患者的生命[1,2]。目前，骨肉瘤的治療方式主要是放療和化療，在骨肉瘤的化療中，多柔比星、順鉑、異環(huán)磷酰胺等為一線治療藥物，其中順鉑治療的副作用較大，容易引發(fā)耐藥性，臨床上多應用順鉑聯(lián)合化療，以此來降低順鉑的毒性以及耐藥性[3]。組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1(LSD1)是一種黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴性胺氧化酶，LSD1已經(jīng)被報道可在多種腫瘤中高表達，包括乳腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌等，可調(diào)控腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并且被認為是干預腫瘤發(fā)生發(fā)展的潛在靶點[4]，SP2509是一種LSD1拮抗劑，可抑制LSD1的表達[5]，本文將SP2509和順鉑聯(lián)合給藥于骨肉瘤細胞，旨在探究SP2509和順鉑對骨肉瘤生物學功能的影響。

1 材料與方法

1.1材料:骨肉瘤細胞系MG-63、HuO9、U-2OS、人成骨細胞hFoB1.19(購自中科院上海細胞庫)，CCK8試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒(購自沈陽萬類生物技術(shù)有限公司)；cDNA合成試劑盒、qRT-PCR試劑盒(福麥斯生物技術(shù)有限公司)；順鉑(購自Sigma公司)；SP2509(購自南京百鑫德諾生物科技有限公司)，LSD1、LC3-Ⅱ、P62、Caspase3、Bcl-2、GAPDH、山羊抗兔IgG(購自Cell Signaling Technology公司)

1.2細胞培養(yǎng):取液氮保存的MG-63細胞，解凍后迅速轉(zhuǎn)移至10mL的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃的恒溫恒濕的細胞培養(yǎng)箱中，細胞貼壁后隔天更換培養(yǎng)基，細胞生長至匯合率達80%時進行細胞傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)研究。

1.3CCK8法檢測細胞增殖抑制率:取對數(shù)生長期的MG-63細胞接種于96孔板中，每孔接種8×103個/100μL，培養(yǎng)至細胞貼壁后，取出96孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，每孔加入不同濃度的SP2509(0、10、20、40、60μmoL/L)和順鉑(0、5、15、25、40μmoL/L)100μL含藥培養(yǎng)液，并設置不接種細胞僅加入培養(yǎng)基的空白對照孔組，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入10μL CCK8溶液，使用酶標儀在450nm下檢測各孔的OD值，細胞抑制率=1-(OD實驗組-OD空白對照組)/(OD正常對照組-OD空白對照組)×100%。用Graphpad prism8.0計算IC50(半數(shù)抑制濃度)值并繪制細胞增殖抑制曲線。

1.4分組與給藥:根據(jù)SP2509和順鉑的IC50值確定IC50值的一半作為給藥濃度，即將MG-63細胞分為對照組、SP2509組(20μmoL/L)、順鉑組(10μmoL/L)、SP2509(20μmoL/L)聯(lián)合順鉑組(10μmoL/L)，按照上述分組將細胞接種于6孔板中，每組3個復孔，分別培養(yǎng)24h后進行細胞凋亡和細胞自噬檢測。

1.5qRT-PCR檢測LSD1 mRNA的表達:根據(jù)TRIzol試劑盒提取MG-63、HuO9、U-2OS、hFoB1.19細胞總RNA，核酸定量后，根據(jù)cDNA試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用qRT-PCR試劑盒進行反應，以GAPDH為內(nèi)參，反應條件為：50℃激活2min、95℃2min、循環(huán)95℃變性15s，60℃退火/延伸1min，共40次循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后設置95℃15s，60℃1min，95℃15s,使用2-△△CT法計算LSD1 mRNA相對表達量。LSD1和GAPDH引物序列見表1。

表1 LSD1和GAPDH引物序列

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡:取對照組、SP2509組(20μmoL/L)、順鉑組(10μmoL/L)、SP2509(20μmoL/L)聯(lián)合順鉑組(10μmoL/L)組細胞各1×105個于流式管中，每組3個復孔，使用無菌PBS清洗2次，根據(jù)細胞凋亡檢測試劑盒，每管加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI染料，避光孵育1h后，用PBS溶液清洗2次后，使用流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡水平。

1.7Western blot檢測LSD1、LC3-Ⅱ、P62、Caspase3、Bcl-2表達:分別收集對照組、SP2509組(20μmoL/L)、順鉑組(10μmoL/L)、SP2509(20μmoL/L)聯(lián)合順鉑組(10μmoL/L)組細胞1×106個于離心管中，并加入200μL的RIPA蛋白裂解液，裂解30min后，12000r離心15min，收集上清即為細胞總蛋白，使用BCA試劑盒進行蛋白定量后，將蛋白樣品與50μL的上樣緩沖液混勻，沸水浴5min后，取各組蛋白10μg進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉、清洗后，將PVDF膜與LC3-Ⅱ、P62、Caspase3、Bcl-2、LSD1抗體4℃條件下共孵育過夜，與山羊抗兔IgG抗體共孵育1.5h后曝光并顯影，使用Image J軟件進行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1LSD1在骨肉瘤細胞中高表達:qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，骨肉瘤細胞系MG-63、HuO9、U-2OS細胞系中LSD1 mRNA表達顯著高于人成骨細胞hFoB1.19細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 hFoB1.19MG-63 HuO9 U-2OS細胞中LSD1mRNA相對表達量比較

2.2SP2509和順鉑IG50檢測結(jié)果:CCK8檢測結(jié)果顯示，SP2509和順鉑對MG-63的抑制率隨著給藥濃度的增加而增加，且呈劑量依賴性，SP2509對MG-63細胞的IC50值約為40μmoL/L，順鉑對MG-63的IC50值約為20μmoL/L，選擇IC50的二分之一作為給藥濃度，即SP2509 20μmoL/L和順鉑10μmoL/L，詳見表3。

表3 SP2509和順鉑細胞抑制率檢測結(jié)果

2.3SP2509聯(lián)合順鉑誘導骨肉瘤細胞的凋亡：流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，相比于對照組，SP2509組和順鉑組MG-63細胞凋亡水平顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SP2509聯(lián)合順鉑組MG-63細胞凋亡水平顯著高于SP2509組和順鉑組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見圖1和表4。Western blot檢測結(jié)果顯示，相比于對照組，SP2509組和順鉑組MG-63細胞促凋亡蛋白Caspase 3表達顯著高于對照組，抑凋亡蛋白Bcl-2表達顯著低于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而SP2509聯(lián)合順鉑組細胞中Caspase 3顯著高于SP2509組和順鉑組，Bcl-2表達顯著低于SP2509組和順鉑組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見圖2和表5。

圖1 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡水平

表4 各組細胞凋亡水平比較

圖2 各組細胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3和Bcl-2表達比較

表5 各組細胞Caspase 3和Bcl-2表達水平比較

2.4SP2509聯(lián)合順鉑誘導骨肉瘤細胞的自噬:Western blot檢測結(jié)果顯示，SP2509組和順鉑組MG-63細胞中LC3-Ⅱ表達顯著高于對照組，P62表達顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。相比于SP2509組和順鉑組，SP2509聯(lián)合順鉑組細胞自噬均顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見圖3和表6，說明SP2509聯(lián)合順鉑可顯著促進骨肉瘤細胞的自噬。

圖3 各組細胞自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和P62表達比較

表6 各組細胞LC3-Ⅱ和P62表達水平比較

2.5SP2509聯(lián)合順鉑調(diào)控骨肉瘤細胞LSD1表達:Western blot檢測結(jié)果顯示，SP2509組MG-63細胞中LSD1表達顯著低于對照組(P<0.05)，順鉑組MG-63細胞中LSD1表達亦顯著低于對照組(P<0.05)，并且顯著高于SP2509組，說明順鉑對LSD1表達亦有抑制作用，但是其抑制效果低于SP2509，相比于SP2509組和順鉑組，SP2509聯(lián)合順鉑組細胞中LSD1表達均顯著下調(diào)(P<0.05)，詳見圖4和表7，說明SP2509聯(lián)合順鉑可顯著抑制骨肉瘤細胞中LSD1的表達。

圖4 Western blot檢測各組細胞LSD1表達

表7 各組細胞LSD1表達水平比較

3 討 論

骨肉瘤是多發(fā)病于骨生長活躍的青少年的骨系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤，起源于間葉組織，其特征為能夠產(chǎn)生骨樣組織的梭形基質(zhì)細胞，骨肉瘤的惡性程度高，在發(fā)病早期就容易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移[6]。目前，化療仍然是骨肉瘤的治療方案之一，其主要的化療藥物有阿霉素、甲氨蝶呤以及順鉑等，其中順鉑應用廣泛，不僅可以通過細胞毒作用直接殺傷腫瘤細胞，還可以通過誘導細胞凋亡發(fā)揮治療作用[7]。雖然近年來新型的化療方式已經(jīng)將骨肉瘤患者5年的生存率提高到近70%，但是大劑量的化療藥物引發(fā)的毒副作用以及耐藥嚴重威脅著患者的治療效果，順鉑治療所導致的腎毒性、胃腸道反應等亦限制了其臨床應用[8]，因此探究更多聯(lián)合用藥方案，降低順鉑化療的毒副作用是骨肉瘤臨床研究的熱點。

LSD1屬于黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性胺氧化酶，它能夠特異性催化組蛋白H3第4位賴氨酸(H3K4)或H3K9位點的去甲基化，參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑進而影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[9]，研究表明，LSD1可參調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，Sheng W等研究表明LSD1的抑制可刺激黑色素瘤對抗PD-1治療，并且增強免疫檢查點的抑制[10]；Xie Q等研究表明LSD1通過上調(diào)LEF1而促進膀胱癌的發(fā)展，并且可作為膀胱癌診斷和治療的潛在靶點[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，LSD1在骨肉瘤細胞MG-63、HuO9、U-2OS中表達顯著高于其在人成骨細胞hFoB1.19中的表達，研究表明，LSD1在乳腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌中高表達，并且抑制LSD1可抑制腫瘤的病理進程[12]。順鉑可通過誘導細胞凋亡而治療腫瘤，LSD1可抑制腫瘤細胞的自噬，SP2509為LSD1的抑制劑，所以本文探究了SP2509聯(lián)合順鉑對骨肉瘤細胞自噬和凋亡的影響。

細胞凋亡檢測結(jié)果顯示，SP2509聯(lián)合順鉑組細胞的凋亡數(shù)顯著高于SP2509組和順鉑組，促凋亡蛋白Caspase 3表達顯著增加，抑凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下調(diào)，說明SP2509聯(lián)合順鉑可促進骨肉瘤細胞的凋亡。細胞自噬檢測結(jié)果顯示，SP2509聯(lián)合順鉑組細胞中LC3-Ⅱ表達顯著高于SP2509組和順鉑組，P62表達顯著低于SP2509組和順鉑組，研究表明LC3-Ⅱ表達與細胞自噬呈正相關(guān)，P62表達與細胞自噬呈負相關(guān)[13]，所以可以得出SP2509聯(lián)合順鉑組可顯著促進骨肉瘤細胞的自噬。并且SP2509聯(lián)合順鉑組細胞LSD1表達顯著低于SP2509組和順鉑組，Ye Wei等研究表明，LSD1可負調(diào)控卵巢癌細胞的自噬進而調(diào)控卵巢癌進程[14]，Angel Chao等研究表明，抑制LSD1可促進P62的穩(wěn)定性，進而影響婦科惡性腫瘤的自噬[15]，本研究推測SP2509聯(lián)合順鉑可通過抑制LSD1表達而促進骨肉瘤細胞的凋亡和自噬。但是本文的研究尚存在一定的局限性，僅在細胞水平驗證了SP2509聯(lián)合順鉑對骨肉瘤細胞的影響，其在動物以及在臨床評價中的效果尚未得到驗證，所以SP2509聯(lián)合順鉑的應用還需進一步探究。

綜上所述，SP2509聯(lián)合順鉑可抑制骨肉瘤細胞MG-63中LSD1的表達，進而誘導腫瘤細胞的凋亡和自噬，本研究為骨肉瘤治療方式的選擇提供新的理論依據(jù)。但其更多潛在的抗腫瘤機制有待進一步深入研究。