黃 金，高 敏

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510000； 2.廣東省第二中醫(yī)院腦病科，廣州510000)

短暫性腦缺血發(fā)作(transient ischemic attack，TIA)是腦、脊髓或視網(wǎng)膜局灶性缺血所致、未發(fā)生急性腦梗死的短暫性神經(jīng)功能障礙[1]。中國(guó)國(guó)家卒中登記研究分別于2007年[2]、2012年[3]和2015年[4]基于醫(yī)院的登記顯示，TIA患者占所有以急性腦血管病入院患者的6.20%、8.00%和6.70%。TIA的發(fā)病意味著更高的潛在腦卒中風(fēng)險(xiǎn)，研究結(jié)果顯示，TIA后2 d、7 d、30 d和90 d腦卒中發(fā)生概率分別為3.5%、5.2%、8.0%和9.2%[5-6]。積極的早期干預(yù)，對(duì)防治TIA進(jìn)展為缺血性腦卒中至關(guān)重要，目前對(duì)于TIA治療及二級(jí)預(yù)防的主流意見(jiàn)均以阿司匹林、氯吡格雷為首選[7-8]。上述兩藥均有不可忽視的消化系統(tǒng)不良反應(yīng)，阿司匹林在直接刺激胃黏膜的同時(shí)抑制環(huán)氧合酶-1，減少前列腺素E2的黏膜保護(hù)作用，引起消化道潰瘍甚至出血[9]；氯吡格雷抑制內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，加重已存在的胃腸道黏膜損傷[10]。

清代醫(yī)家王清任認(rèn)為“元?dú)獠蛔恪笔侵酗L(fēng)病發(fā)生的根本原因，立益氣活血法，創(chuàng)補(bǔ)陽(yáng)還五湯[11]。芪歸通絡(luò)口服液為廣東省第二中醫(yī)院專(zhuān)科特色制劑(批準(zhǔn)文號(hào)：粵藥制字Z20090014)，根據(jù)補(bǔ)陽(yáng)還五湯加減化裁，主要由黃芪、當(dāng)歸、三七、赤芍、丹參、地龍、牛膝和雞血藤8味藥物組成，有補(bǔ)氣通絡(luò)、活血化瘀和強(qiáng)筋骨之效，在臨床被廣泛用于各類(lèi)缺血性腦血管的氣虛血瘀證，療效可靠，不良反應(yīng)少。但其具體機(jī)制尚未深入闡明。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，試探索芪歸通絡(luò)口服液治療TIA的可能作用機(jī)制，并進(jìn)行分子模擬對(duì)接的初步驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1 化學(xué)成分庫(kù)的構(gòu)建

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)[12]、中醫(yī)藥百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)(ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/)[13]并結(jié)合文獻(xiàn)檢索，收集黃芪、當(dāng)歸、三七、赤芍、丹參、地龍、牛膝和雞血藤的主要化學(xué)成分。

1.2 活性化合物的篩選

中醫(yī)湯劑以口服為主，選取口服生物利用度(OB)、類(lèi)藥性(DL)對(duì)化合物的吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代謝(Metabolism)和排泄(Excretion)性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，評(píng)價(jià)其潛在活性[14]。將來(lái)自TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的化學(xué)成分以O(shè)B≥30%、DL≥0.18作為篩選條件[15]；將來(lái)自ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)的化學(xué)成分以Druglikeness Grading評(píng)分為“Moderate”或“Good”，Druglikeness Weight≥0.5作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 藥物與疾病的靶點(diǎn)收集

通過(guò)檢索TCMSP、ETCM、DrugBank和PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)，PubMed、中國(guó)知網(wǎng)和萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行文獻(xiàn)挖掘收集，獲取藥物的潛在靶點(diǎn)。通過(guò)GeneCards、人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳綜合數(shù)據(jù)庫(kù)獲取TIA的疾病靶標(biāo)。

1.4 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

利用Cytoscape 3.7.0軟件[16]構(gòu)建中藥復(fù)方-單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)-疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)模型，利用Network Analyzer功能獲得的度值和中介度等參數(shù)對(duì)模型進(jìn)行分析。使用Cytoscape中的Generate style from statistics工具將節(jié)點(diǎn)大小、邊的粗細(xì)與度值、Combine score大小相適應(yīng)。

1.5 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/, Version 11.0)[17]基于多種數(shù)據(jù)來(lái)源和證據(jù)，收錄豐富的蛋白質(zhì)及其相互作用信息。將獲取的藥物-疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)信息，導(dǎo)出為T(mén)SV格式，輸入Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行分析。

1.6 靶點(diǎn)的分子功能/生物過(guò)程和通路富集分析

使用WebGestalt在線(xiàn)工具(http://www.webgestalt.org/)[18]進(jìn)行基因本體(GO)功能富集分析。選擇物種為“homo sapiens”，采用Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)富集分析算法，分別對(duì)生物學(xué)過(guò)程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞組成(CC)進(jìn)行GO富集分析，并繪制柱狀圖。將篩選得到的交集靶點(diǎn)輸入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析。

1.7 分子對(duì)接

選取活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中度值較大的活性成分與蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行初步的分子對(duì)接驗(yàn)證。從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)下載小分子的mol文件，于PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)獲取蛋白的PDB文件。使用Autodock 4.2.6軟件[19]進(jìn)行蛋白-分子對(duì)接，利用Pymol 2.2軟件對(duì)蛋白進(jìn)行除氫、去水和去除小分子配體等預(yù)處理以及對(duì)接結(jié)果的可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 芪歸通絡(luò)口服液中的活性成分及對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)信息

經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)、ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)以及相關(guān)文獻(xiàn)檢索查找，去除重復(fù)項(xiàng)，共獲取芪歸通絡(luò)口服液全方符合條件的化學(xué)成分：黃芪49種，當(dāng)歸48種，赤芍32種，牛膝23種，丹參114種，雞血藤41種，三七32種，地龍8種，共347種化學(xué)成分。進(jìn)一步得到潛在靶點(diǎn)403個(gè)，疾病靶標(biāo)218個(gè)。繪制韋恩圖，見(jiàn)圖1。芪歸通絡(luò)口服液、TIA交集得到40個(gè)重合靶點(diǎn)，即藥物-疾病共同靶點(diǎn)。

圖1 藥物與疾病靶點(diǎn)基因交集韋恩圖

2.2 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

利用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建中藥復(fù)方-單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)-疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，共137個(gè)節(jié)點(diǎn)，357條邊，見(jiàn)圖2。六邊形節(jié)點(diǎn)表示芪歸通絡(luò)口服液整體復(fù)方，八邊形節(jié)點(diǎn)表示疾病TIA，正方形節(jié)點(diǎn)表示各中藥組成，平行四邊形節(jié)點(diǎn)表示中藥所含化學(xué)成分，圓形節(jié)點(diǎn)表示藥物-疾病共同靶點(diǎn)，并依次相互連接。節(jié)點(diǎn)度值表示節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的連接度[20]。本網(wǎng)絡(luò)中，度值較高的節(jié)點(diǎn)，中藥有丹參(30)、黃芪(17)和當(dāng)歸(14)；化合物有槲皮素(quercetin)(33)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)(14)、木犀草素(luteolin)(12)和大豆苷元(daidzein)(10)；靶點(diǎn)有雌激素受體1(ESR1)(56)、胱天蛋白酶3(CASP3)(22)、凝血因子7(F7)(10)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)(10)和白細(xì)胞介素6(IL-6)(10)。

2.3 藥物-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過(guò)Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3。圖中共包含40個(gè)節(jié)點(diǎn)，245個(gè)邊，節(jié)點(diǎn)平均度值為12.2，平均局部聚類(lèi)系數(shù)為0.637，PPI富集均值<1.0×10-16。

圖2 芪歸通絡(luò)口服液?jiǎn)挝端?活性成分-作用靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)的GO功能富集分析

經(jīng)WebGestalt分析平臺(tái)對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，繪制柱狀圖，見(jiàn)圖4。其中，BP相關(guān)主要涉及刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、定位和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等；MF相關(guān)主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合、水解酶活性、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性和酶調(diào)節(jié)活性等；CC相關(guān)主要涉及細(xì)胞膜、囊泡、蛋白質(zhì)復(fù)合體、內(nèi)膜系統(tǒng)、膜封閉腔和細(xì)胞外間隙等。結(jié)果提示，芪歸通絡(luò)口服液治療TIA相關(guān)的關(guān)鍵靶標(biāo)可能與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞膜和調(diào)節(jié)酶的活性等BP有一定關(guān)系。

A.BP；B.CC；C.MFA.BP；B.CC；C.MF

2.5 KEGG通路富集分析結(jié)果

通過(guò)KEGG通路富集分析，獲取芪歸通絡(luò)口服液治療TIA相關(guān)的通路，得到P<0.05的信號(hào)通路77條，以Count值降序篩選處排序居前20位的KEGG通路輸出柱形圖和氣泡圖。結(jié)果提示，關(guān)鍵基因靶點(diǎn)主要涉及糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway indiabetic complications)、缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、血小板激活(platelet activation)和流體剪切力與動(dòng)脈粥樣硬化通路(fluid shear stress and atherosclerosis)等，見(jiàn)圖5。

圖3 芪歸通絡(luò)口服液靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對(duì)接結(jié)果

圖2中節(jié)點(diǎn)度值較高的活性成分有槲皮素、木犀草素和大豆苷元，核心靶點(diǎn)蛋白包括CASP3、VEGFA和IL-6，分別進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表1。并進(jìn)行分子對(duì)接模式圖展示，見(jiàn)圖6。結(jié)果顯示，各活性成分與蛋白對(duì)接的結(jié)合自由能均<-20.93 kJ/mol，有較高的親和力[21]。

A.IL-6與大豆苷元對(duì)接圖；B.VEGFA與大豆苷元對(duì)接圖；C.CASP3與大豆苷元對(duì)接圖；D.IL-6與木犀草素對(duì)接圖；E.VEGFA與木犀草素對(duì)接圖；F.CASP3與木犀草素對(duì)接圖；G.IL-6與槲皮素對(duì)接圖；H.VEGFA與槲皮素對(duì)接圖；I.CASP3與槲皮素對(duì)接圖A. docking diagram of IL-6 and daidzein; B. docking diagram of VEGEFA and daidzein; C. docking diagram of CASP3 and daidzein; D. docking diagram of IL-6 and luteolin; E. docking diagram of VEGFA and luteolin; F. docking diagram of CASP3 and luteolin; G. docking diagram of IL-6 and quercetin; H. docking diagram of VEGEFA and quercetin; I. docking diagram of CASP3 and quercetin

表1 主要活性成分與疾病靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

本研究進(jìn)行了“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及多層次功能分析，結(jié)果提示，芪歸通絡(luò)口服液中蚓激酶(earthworm fibrinolytic enzyme)、槲皮素、木犀草素、大豆苷元、丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA)和丹酚酸A(salvianolic acid A)等為芪歸通絡(luò)口服液全方的主要活性成分；ESR1、CASP3、F7、VEGFA、纖溶酶原(PLG)和P2Y嘌呤受體12等靶標(biāo)作用于HIF-1、Platelet activation、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)等信號(hào)通路是干預(yù)TIA的關(guān)鍵路徑。

圖5 芪歸通絡(luò)口服液治療TIA潛在核心靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，中風(fēng)病氣虛血瘀證的用藥中，地龍的使用頻次高居第3位，與當(dāng)歸并列，可見(jiàn)其獨(dú)特作用[22]。地龍藥用歷史悠久，《神農(nóng)本草經(jīng)》[23]中已有記載，《滇南本草》[24]謂其“味苦、辛，性寒。祛風(fēng)。治……口眼歪斜”。清代醫(yī)家葉天士指出，蟲(chóng)類(lèi)藥“飛者升，走者降，靈動(dòng)迅速，追拔沉混氣血之邪”[25]，非普通草木、礦石之藥所能及。藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，地龍富含脂類(lèi)[26]、蛋白質(zhì)[27]、酶類(lèi)、氨基酸[28]、微量元素[29]和核苷酸[30]等成分，其中蚓激酶在治療腦血管病中起到核心作用。蚓激酶具有纖溶酶活性，有組織纖溶酶原激活物和抗纖溶酶原激活物抑制劑樣作用，能通過(guò)激活纖溶酶原，產(chǎn)生降解纖維蛋白和纖維蛋白原的纖溶酶[31]；另一方面，能增加組織間其他纖維蛋白溶酶原激活物的活性，抑制凝血途徑[32]?！吨袊?guó)急性缺血性腦卒中診治指南2010》[33]推薦，血漿纖維蛋白原和血液黏滯度升高的缺血性腦血管病患者使用蚓激酶進(jìn)行降纖治療。本研究的藥物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)顯示，蚓激酶作用于PLG靶點(diǎn)，在一定程度上闡釋了蟲(chóng)類(lèi)藥“通經(jīng)達(dá)絡(luò)，搜剔疏利”獨(dú)特功效的藥理學(xué)內(nèi)在機(jī)制。槲皮素為三七、黃芪和牛膝的共有成分，作用于CASP3、F7、VEGFA、IL-6、ALOX5和NOS3等多個(gè)靶點(diǎn)。槲皮素通過(guò)下調(diào)CD80、CD86、MHC-Ⅱ、IL-6和IL-12的表達(dá)，降低刺激T細(xì)胞異基因增殖的能力，并上調(diào)Dabs蛋白表達(dá)，抑制樹(shù)突細(xì)胞成熟，從而下調(diào)SRC/PI3K/Akt/核因子κB炎癥途徑來(lái)抑制炎癥反應(yīng)和AS的形成[34]。

ESR1是本網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中最高節(jié)點(diǎn)度值的靶點(diǎn)，大量活性成分作用與該靶點(diǎn)相互作用。ESR1作為經(jīng)典核受體，與神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)活動(dòng)相關(guān)，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮“基因型”調(diào)節(jié)效應(yīng)[35]。研究結(jié)果表明，雌激素通過(guò)拮抗興奮性氨基酸毒性[36]、抗氧化應(yīng)激[37]、增加腦部血流量[38]、抑制凋亡通路[39-40]和抑制動(dòng)脈粥樣硬化[41]等多個(gè)過(guò)程參與調(diào)節(jié)缺血性腦卒中的發(fā)生。芪歸通絡(luò)口服液全方共52種成分作用于ESR1靶點(diǎn)，其中大豆苷元[42]、丹參酮ⅡA[43]等代表性雌激素成分，起到防治腦血管病的重要作用。

KEGG通路富集結(jié)果顯示，在HIF-1、Platelet activation等信號(hào)通路上有較高的富集程度。缺氧是神經(jīng)細(xì)胞低灌注下的損傷機(jī)制之一。HIF在缺氧應(yīng)激條件下充當(dāng)許多缺氧誘導(dǎo)基因的主要調(diào)節(jié)因子，通過(guò)快速調(diào)節(jié)氧依賴(lài)性信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)和下游基因的活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)能量利用水平，以改善缺血性疾病中代謝的變化[44]。缺氧條件下，經(jīng)上游的mTOR、絲裂原激活的蛋白激酶和PI3K-Akt多個(gè)信號(hào)通路作用，激活HIF-1α轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)下游的VEGF信號(hào)通路，阻斷細(xì)胞凋亡[45]，并對(duì)神經(jīng)有直接保護(hù)作用[46]；同時(shí)激活iNOS、eNOS，使血管平滑肌松弛，降低血壓，并改善局部腦組織再灌注[47]。抗血小板治療是目前防治TIA的一線(xiàn)選擇，本研究結(jié)果顯示，芪歸通絡(luò)口服液全方在Platelet activation信號(hào)通路上富集的有P2Y12、PI3K、Akt、F2和eNOS等靶點(diǎn)。PI3K/AKT通路是誘導(dǎo)血小板顆粒釋放、激活及黏附的上游信號(hào)放大途徑之一。PI3K家族中，PI3Kβ、PI3Ky在血小板信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用[48]；PI3K的激活可致血小板內(nèi)Akt的主要亞型Akt-1和Akt-2磷酸化，進(jìn)一步激活下游eNOS等靶點(diǎn)，介導(dǎo)血小板激活過(guò)程[49]。丹參中有效成分丹酚酸A，即通過(guò)該信號(hào)通路有效抑制下游分子Akt的磷酸化，降低血小板激活[50]。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了芪歸通絡(luò)口服液對(duì)TIA的潛在作用機(jī)制，采用分子模擬對(duì)接進(jìn)行了初步驗(yàn)證，為芪歸通絡(luò)口服液多成分、多靶點(diǎn)、多通路綜合防治TIA的可能作用機(jī)制提供了參考，為后續(xù)更深入、切實(shí)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究提供了一定的理論方向。