馬致潔，董捷鳴，于小紅，李 萌，陳 熹，趙奎君，饒 全#，章從恩#

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100050； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院普外科，北京 100050)

雷公藤為衛(wèi)矛科植物雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)的干燥根，因其毒性較大，傳統(tǒng)以外用為主，不予內(nèi)服，直至1974年首次將雷公藤內(nèi)服用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[1]。雷公藤作為一味經(jīng)典毒性中藥，古代醫(yī)籍中對其炮制方法的記載甚少，現(xiàn)代應(yīng)用時以凈制為主，去除毒性較大的外皮，取毒性較小的木質(zhì)入藥，但仍易出現(xiàn)不良反應(yīng)以及藥物性中毒事件[2-3]。同時，隨著皮部有效成分的丟失，其有效性也受到影響。微生物發(fā)酵炮制時，微生物中的酶系與雷公藤中的成分發(fā)生一系列有機(jī)反應(yīng)，容易改變原有成分或者增加一些新的毒性物質(zhì)。在傳統(tǒng)發(fā)酵過程中，由于菌種的不確定性和有毒菌株的混入，難以保障發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量的均一性和安全性[4-5]。目前公認(rèn)的炮制減毒方法是以輔料炮制，但在雷公藤炮制減毒方面的研究較少。近期國內(nèi)學(xué)者也系統(tǒng)比較了不同炮制方法對雷公藤藥效和肝毒性的影響[6-9]。研究結(jié)果表明，在諸多炮制方法中，甘草汁炮制雷公藤增效減毒效果較佳，前期課題組已建立了甘草炮制雷公藤的方法，并證實了甘草炮制減毒的客觀性，但減毒機(jī)制仍未完全闡釋清楚[10-11]。

高遷移率族蛋白1(HMGB1)為存在于哺乳動物組織細(xì)胞核內(nèi)的蛋白。HMGB1可由激活的免疫細(xì)胞或壞死細(xì)胞釋放至胞外，通過Toll樣受體4(TLR4)和鈣調(diào)節(jié)通道介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與免疫性疾病的發(fā)生[12-13]。在脂多糖/D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的肝損傷中，HMGB1被釋放至胞外，激活樹突狀細(xì)胞，啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答[14-15]。課題組前期研究結(jié)果驗證了雷公藤致大鼠肝損傷的機(jī)制可能與其激活了HMGB1-TLR4/核因子κB(NF-κB)炎癥通路有關(guān)[16-17]。本研究繼續(xù)探討甘草制雷公藤降低肝毒性與HMGB1介導(dǎo)的炎癥通路的關(guān)系，以期為闡釋甘草炮制雷公藤減毒的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

實驗動物為SPF級SD大鼠，雄性，4～5周齡，體重(200±20)g，共24只(購自華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證號：11401300054115)。將大鼠隨機(jī)分籠飼養(yǎng)于SPF級實驗室，4只/籠，保證大鼠有充足的活動空間，期間維持室內(nèi)溫度為25 ℃左右、相對濕度為50±2%，每12 h進(jìn)行晝夜燈光交替1次。

1.2 儀器

XS205型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠)；Centrifuge 5424R小型冷凍高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；CKX41型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；BS-300型自動生化儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；SpectraMax?M3酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)；Vortex-Genie 2型多功能旋渦混合器(美國Scientific Industries公司)。

1.3 藥材與試劑

雷公藤購自福建省三明市，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院中藥劑科趙奎君教授鑒定為衛(wèi)矛科雷公藤的干燥根莖；生甘草飲片(產(chǎn)地：內(nèi)蒙古；生產(chǎn)批號：SB7131)購自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院中藥房。HMGB1(大鼠)試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；大鼠白細(xì)胞介素(IL)1β、IL-2、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購自美國ThermoFisherScientific公司；HMGB1(大鼠)抗體、TLR4(大鼠)抗體均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；NF-κB(大鼠)抗體購自美國CST公司；二抗(山羊抗兔鼠通用)購自以色列Biological Industries生物科技公司；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒均購南京建成生物工程研究所有限公司；其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 雷公藤樣品的制備

稱取約2 500 g雷公藤生藥，切碎為大小約2～3 cm的不規(guī)則碎塊，取其中1/2(另1/2用于炮制)，按比例稱量8倍體積去離子水，用去離子水浸泡30 min；然后用電磁爐煎煮，輸出功率維持在1 000 W左右，煎煮40 min；然后用0.25 cm藥篩過濾，過濾后再次加入稱量好的8倍體積去離子水，再次煎煮40 min，以相同條件過濾，合并兩次濾液，將合并后的濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，放入4 ℃冰箱，使用時再稀釋。

2.2 甘草炮制雷公藤樣品制備

2.2.1 甘草汁的制備：按雷公藤-甘草飲片質(zhì)量比3∶1來稱量所需的甘草片，以8倍體積的水提前浸泡甘草飲片30 min，然后煎煮20 min，用0.25 cm藥篩過濾，收集濾液；采用相同方法煎煮3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將合并后的濾液濃縮至合適體積，備用。

2.2.2 甘草制雷公藤樣品的制備：將上述另1/2已經(jīng)切碎為2～3 cm碎塊的雷公藤生藥稱量，分批放于1 000 mL燒杯里，加入制備好的甘草汁，以3∶1的質(zhì)量比浸泡雷公藤生藥，常溫(25 ℃)過夜，甘草汁需沒過雷公藤，使雷公藤充分吸收甘草汁。將浸泡過夜充分吸收甘草汁的雷公藤放入鍋內(nèi)，加熱并維持100 ℃，炒制10 min至雷公藤表面不粘手，得到甘草制雷公藤樣品。使用“2.1”項下方法制成甘草炮制雷公藤的水煎劑，臨用前配制成相應(yīng)濃度(給藥劑量以雷公藤生藥量計)。

2.3 動物分組與給藥

將24只SD大鼠隨機(jī)分為3組，分別為空白對照組、雷公藤組(相當(dāng)于生藥16 g/kg)和甘草炮制雷公藤組(相當(dāng)于雷公藤生藥16 g/kg)。給藥組大鼠連續(xù)灌胃給藥3周，空白對照組大鼠灌胃相同體積的0.9%氯化鈉溶液。

2.4 動物取材及指標(biāo)檢測

每隔7 d于大鼠尾靜脈取血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清中肝臟生化指標(biāo)AST和ALT水平；末次給藥結(jié)束，取血檢測大鼠血清中炎癥因子HMGB1、IL-1β、IL-2和TNF-α水平；末次給藥結(jié)束后(第21日)，取大鼠肝臟組織，一部分放入配好的福爾馬林里為蘇木精-伊紅(HE)染色切片備用；另一部分放入液氮中，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測肝臟組織中HMGB1、TLR4和NF-κB的表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 血清中ALT、AST含量檢測結(jié)果

給藥1周，空白對照組、雷公藤組和甘草炮制雷公藤組大鼠組間ALT、AST含量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。雷公藤組大鼠給藥2周后的血清ALT、AST含量高于空白對照組(P<0.05)，給藥3周后顯著高于空白對照組(P<0.01)；同時雷公藤組大鼠給藥2周后的血清ALT、AST含量高于甘草炮制雷公藤組(P<0.05)，且給藥3周后顯著高于甘草炮制雷公藤組(P<0.01)，上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。甘草炮制雷公藤組大鼠血清AST含量在給藥3周后高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ALT含量在不同給藥時間與空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 三組大鼠血清ALT、AST含量的檢測結(jié)果比較

3.2 血清中炎癥因子檢測結(jié)果

與空白對照組相比，雷公藤組大鼠的血清TNF-α、IL-1β和HMGB1含量均升高(P<0.01)，血清IL-2含量升高(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。甘草炮制雷公藤組大鼠與空白對照組上述血清炎癥因子含量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與雷公藤組相比，甘草炮制雷公藤組大鼠血清TNF-α、IL-1β和HMGB1含量明顯降低(P<0.01)，血清IL-2含量降低(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 三組大鼠血清炎癥因子檢測結(jié)果比較

3.3 肝組織中HMGB1炎癥通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

與空白對照組相比，雷公藤組大鼠肝臟中HMGB1、TLR4和NF-κB表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與空白對照組相比，甘草炮制雷公藤組大鼠TLR4、NF-κB表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；甘草炮制雷公藤組大鼠HMGB1表達(dá)與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與雷公藤組相比，甘草炮制雷公藤組大鼠TLR4、NF-κB表達(dá)降低(P<0.05)，HMGB1表達(dá)顯著降低(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表3、圖1。

A.空白對照組；B.雷公藤組；C.甘草制雷公藤組Note: A. blank control group; B. Tripterygium wilfordii group; C. licorice-processed Tripterygium wilfordii group

表3 三組大鼠肝臟組織中HMGB1通路相關(guān)蛋白條帶灰度值比值結(jié)果比較

3.4 肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果

空白對照組大鼠肝臟組織HE染色均勻，肝臟小葉結(jié)構(gòu)清晰，呈放射狀緊密排列，肝細(xì)胞形態(tài)良好；雷公藤組大鼠肝臟小葉排列紊亂，肝竇輕度擴(kuò)張，部分肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見圓形空泡和脂肪變性，局部區(qū)域出現(xiàn)點狀炎癥浸潤灶；甘草炮制雷公藤組大鼠肝臟組織HE染色均勻，肝臟小葉結(jié)構(gòu)清晰，呈放射狀排列整齊，肝細(xì)胞形態(tài)良好，無明顯肝損傷表現(xiàn)，見圖2。

A.空白對照組(×40)；B.空白對照組(×200)；C.空白對照組(×400)；D.雷公藤組(×40)；E.雷公藤組(×200)；F.雷公藤組(×400)；G.甘草炮制雷公藤組(×40)；H.甘草炮制雷公藤組(×200)；I.甘草炮制雷公藤組(×400)A.blank control group(×40)；B.blank control group(×200)；C.blank control group(×400)；D.Tripterygium wilfordii group(×40)；E.Tripterygium wilfordii group(×200)；F.Tripterygium wilfordii group(×400)；G.licorice-processed Tripterygium wilfordii group(×40)；H.licorice-processed Tripterygium wilfordii group(×200)；I.licorice-processed Tripterygium wilfordii group(×400)

4 討論

雷公藤在自身免疫性疾病尤其是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療中的效果尤為顯著[17]。研究結(jié)果表明，低劑量使用雷公藤紅素具有顯著的減肥效果，應(yīng)用前景廣泛[18]。但由于雷公藤的活性成分同時也是其毒性成分，導(dǎo)致臨床應(yīng)用過程中極易出現(xiàn)不良反應(yīng)，近年來報道的藥物性肝損傷事件中，雷公藤位列單味中藥之首[19]。雷公藤的不良反應(yīng)限制了其在臨床中的應(yīng)用和發(fā)展，因此，雷公藤的減毒存效研究極為重要。在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，深入研究雷公藤毒性發(fā)生的機(jī)制，通過不同炮制配伍方法降低毒性，并保持或提高雷公藤的療效，是合理開發(fā)應(yīng)用雷公藤的重要課題。近年來，課題組一直致力于雷公藤的毒性及藥效學(xué)的研究。根據(jù)中藥藥性理論，甘味藥可以緩和藥性。甘草有“解百草毒”之名，“得中和之性，有調(diào)補(bǔ)之功”，被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品[20]。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中提出“肝苦急，急食甘以緩之”，雷公藤的肝毒性可佐以甘草緩之，起到養(yǎng)護(hù)肝臟之效[21]。因此，利用甘草炮制雷公藤增效減毒符合中醫(yī)傳統(tǒng)理論。前期研究中，課題組發(fā)揮甘草汁炮制毒性中藥的優(yōu)勢，結(jié)合甘草保肝的現(xiàn)代研究成果，開展甘草汁炮制雷公藤降低肝毒性的研究，建立了甘草汁炮制雷公藤的方法，并證實了甘草炮制降低肝毒性的作用[10-11,16-17,22-23]。

HMGB1是一種重要的促炎因子，其主要受體為TLR和晚期糖基化終端產(chǎn)物受體[12]。研究結(jié)果表明，在多種肝損傷疾病中，HMGB1表達(dá)水平明顯升高。HMGB1在炎癥反應(yīng)中被釋放，遷移到胞外，與相應(yīng)受體特異性結(jié)合，通過調(diào)節(jié)NF-κB入核，激活下游因子的表達(dá)，來促進(jìn)炎癥發(fā)生[24-28]。課題組前期已證實雷公藤的肝毒性與其激活HMGB1通路有關(guān)，本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了甘草炮制雷公藤降低肝毒性與HMGB1通路的關(guān)系，為解釋甘草炮制雷公藤減毒的機(jī)制提供依據(jù)。當(dāng)

然，甘草炮制雷公藤減毒還有其他減毒的內(nèi)在機(jī)制，包括化學(xué)成分的改變、體內(nèi)靶點的改變等，需要繼續(xù)研究和探索。另外，在關(guān)注雷公藤減毒的前提下，也應(yīng)關(guān)注其藥理活性，在合理避毒的情況下，充分發(fā)揮雷公藤的強(qiáng)大免疫抑制能力才是最終目的，課題組后期會持續(xù)進(jìn)行相關(guān)研究。