彭 震， 朱 里， 羅 慶， 高建有， 查滿榮， 彭小列， 郭惠紅， 劉世彪

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 湖南 吉首 416000；2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 北京 100083)

絞股藍(lán)(Gynostemmapentaphyllum)別名七葉膽、五葉參、公羅鍋底等，是葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤本植物。主要分布于秦嶺以南地區(qū)，因其所含的絞股藍(lán)皂苷(gypenosides)與人參皂苷(ginsenoside)具有相同的達(dá)瑪烷構(gòu)型而被譽(yù)為“南方人參”。此外絞股藍(lán)還含有黃酮類、多糖、氨基酸等多種生理活性物質(zhì)，其藥理功效包括保護(hù)肝臟和心血管、抗炎癥和病毒、調(diào)節(jié)免疫和神經(jīng)系統(tǒng)功能、抗腫瘤抗氧化、降血糖血脂等，可用于多種病癥的治療，是一種重要的藥食兩用植物和保健植物[1-2]。

絞股藍(lán)有種子繁殖和營(yíng)養(yǎng)繁殖兩種形式。自然條件下其營(yíng)養(yǎng)繁殖通常以地下根狀莖分蘗、匍匐莖節(jié)位形成不定根和不定芽形式產(chǎn)生新的植株。但在秋末冬初時(shí)，絞股藍(lán)存在一種特殊的營(yíng)養(yǎng)繁殖現(xiàn)象：其藤蔓會(huì)下垂生長(zhǎng)，芽端觸地后節(jié)間伸長(zhǎng)膨大，末端彎曲并鉆入土中越冬，并在地下形成根狀莖，這種芽一般稱之為“珠芽”[3]。珠芽在地下分化出多個(gè)側(cè)芽和側(cè)枝，來(lái)年開春后可萌發(fā)出數(shù)株新苗，而原來(lái)的母株藤蔓則在冬季枯死[4]。對(duì)于絞股藍(lán)的這種生長(zhǎng)行為，人們通常視之為適應(yīng)寒冷環(huán)境的越冬和繁殖策略。楊琦[5]研究發(fā)現(xiàn)，在各階段中的絞股藍(lán)地上莖向根狀莖發(fā)育轉(zhuǎn)變過程中，其組織結(jié)構(gòu)相似，只是后期的細(xì)胞體積明顯增大，地下根狀莖的皮層淀粉鞘和髓細(xì)胞中的淀粉粒數(shù)量和體積明顯增大。目前對(duì)絞股藍(lán)莖端向根狀莖轉(zhuǎn)化的生理變化尚不了解，但筆者觀察發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)莖端在秋末會(huì)沿地面朝暗處生長(zhǎng)，莖端黃化并膨大，繼而再鉆入土中，因此推測(cè)秋冬的短日照可能是其行為變化的重要誘因。為此，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了暗誘導(dǎo)條件下絞股藍(lán)莖端轉(zhuǎn)化為根狀莖過程中的內(nèi)源激素和糖分含量變化，以進(jìn)一步探索其莖端形態(tài)和行為轉(zhuǎn)化的生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為生長(zhǎng)正常的平利2號(hào)絞股藍(lán)，盆栽于吉首大學(xué)種質(zhì)圃。實(shí)驗(yàn)于2020年6月中下旬進(jìn)行。

1.2 儀器與試劑

FA 1204電子天平，TG-16 G臺(tái)式高速離心機(jī)，T 6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，AGLIENT 1290高效液相色譜儀，SCIEX-6500 Qtrap(MSMS)，CHA-2氣浴恒溫?fù)u床，水浴氮吹儀；茉莉酸(JA)標(biāo)準(zhǔn)品和吲哚乙酸(IAA)標(biāo)準(zhǔn)品、赤霉素(GA3、GA4、GA7)標(biāo)準(zhǔn)品，CNWC 18 QuEChers填料，色譜級(jí)甲醇和乙腈。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1絞股藍(lán)莖端的暗處理及取樣

取大小為16 cm×4.5 cm的透明聚酯PET塑料瓶，用2層黑色塑料膜緊纏于外面，瓶蓋開小孔以套進(jìn)絞股藍(lán)莖端，以不纏膜的塑料瓶為對(duì)照。選取同一株長(zhǎng)勢(shì)與形態(tài)相似的絞股藍(lán)的5枝藤蔓，其中3枝的莖端分別置于暗處理瓶中，1枝莖端置于對(duì)照瓶中，莖端插入瓶中約10 cm,剩余1枝直接剪下芽尖至第4節(jié)材料作為初始期。抽樣觀察表明，暗處理3 d的莖端進(jìn)入黃化膨大期，暗處理6 d的莖端進(jìn)入變態(tài)芽期(出現(xiàn)頂端彎曲，自然條件下由彎曲處接觸土面并鉆入)，暗處理8 d后的莖端進(jìn)入根狀莖期(第3～5節(jié)長(zhǎng)出不定根)，而在對(duì)應(yīng)時(shí)間的對(duì)照組瓶?jī)?nèi)莖端均無(wú)上述變化(圖1)。 在各時(shí)期取樣，剪取各時(shí)期材料的芽尖至第4節(jié)材料，迅速浸入液氮中，轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱中保存，用于激素含量測(cè)定。剪取相應(yīng)材料貯存于-80 ℃冰箱保存，用于糖含量測(cè)定。3次生物學(xué)重復(fù)。

注：A為暗處理；B為對(duì)照莖端；C為黃化膨大期莖端；D為變態(tài)芽期莖端；E為根狀莖期莖端。圖1 絞股藍(lán)莖端暗處理及其4個(gè)典型形態(tài)時(shí)期Fig.1 Dark treatment for stem apex and three development stages of G.pentaphyllum

1.3.2絞股藍(lán)莖端激素含量測(cè)定

采用液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)IAA、赤霉素類(GA3、GA4、GA7)和JA濃度。

1) 配置標(biāo)曲溶液：取1.5 mL離心管，加入甲醇溶液994 μL與2 μL濃度為500 μg/mL激素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，搖晃震蕩均勻，配置成終濃度1 μg/mL的母液。取甲醇溶液和母液配置為終濃度0.1 ng/mL，0.2 ng/mL，0.5 ng/mL，2 ng/mL，5 ng/mL，20 ng/mL，50 ng/mL，200 ng/mL的標(biāo)曲溶液。

2) 流動(dòng)相配置：色譜純甲醇900 mL作為有機(jī)相加入1 L容量瓶，再加入1 mL甲酸，以色譜純甲醇定容至1 L并混勻。取超純水900 mL加入1 L容量瓶作為無(wú)機(jī)相，再加入1 mL甲酸，以超純水定容至1 L并混勻。

3) 植物激素提取步驟：在10倍體積乙腈溶液中加入精確稱取的樣品0.1 g，4 ℃環(huán)境下提取過夜，12 000 r/min離心5 min，取其上清液；沉淀后再加一次5倍體積乙腈溶液，合并提取2次后所得上清液；加入10 mg C 18填料，劇烈震蕩30 s，10 000 r/min離心5 min，取上清液；氮?dú)獯蹈珊笤僖?00 μL甲醇復(fù)溶，過0.22 μm孔有機(jī)相濾膜，放入-20 ℃冰箱低溫保存，待上機(jī)檢測(cè)。

4) HPLC-MS/MS檢測(cè)：液相條件為色譜柱：poroshell 120 SB-C 18反相色譜柱(2.1×150，2.7 μm)；柱溫30 ℃，流動(dòng)相：A∶B=(甲醇/0.1%甲酸)∶(水/0.1%甲酸)；進(jìn)樣量：2 μL，進(jìn)行梯度洗脫，梯度條件如表1。質(zhì)譜參數(shù)：以ESI正負(fù)離子模式分別監(jiān)測(cè)為電離方式。掃描類型：MRM，氣簾氣：15 psi，噴霧電壓：+4 500 V，-4 000 V，霧化氣壓力：65 psi，輔助氣壓力：70 psi，霧化溫度：400 ℃。

表1 液相梯度參數(shù)Table 1 Gradient parameters of HPLC

1.3.3絞股藍(lán)莖端糖含量測(cè)定

采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定絞股藍(lán)莖端樣品中的糖含量(鮮重)。采用間苯二酚法于480 nm處測(cè)吸光值換算成蔗糖和果糖含量，蒽酮比色法于625 nm處測(cè)吸光值換算成可溶性糖和淀粉含量，DNS(二硝基水楊酸)法于520 nm處測(cè)吸光值換算成還原糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 絞股藍(lán)莖端植物激素含量的動(dòng)態(tài)變化

圖2顯示，在暗處理前后的絞股藍(lán)四個(gè)典型形態(tài)時(shí)期中，IAA含量呈波動(dòng)態(tài)勢(shì)，與初始期(1.45 ng/g)相比，黃化膨大期的IAA含量上升至最高水平(3.13 ng/g),在變態(tài)芽期IAA含量有所下降(1.50 ng/g)，在根狀莖期含量又有所上升(2.30 ng/g)。GA類激素含量從初始期的1.12 ng/g急劇上升至黃化膨大期的最高值(5.74 ng/g)，后又急劇下降到變態(tài)芽期的0.58 ng/g，再平緩下降至根狀莖期的0.32 ng/g。絞股藍(lán)莖尖的JA含量水平最高，在11～41 ng/g之間，暗處理后其含量由初始期的33.30 ng/g上升到黃化膨大期的40.53 ng/g，之后再下降至變態(tài)莖期的30.62 ng/g和根狀莖期的11.47 ng/g?？傮w來(lái)看，黃化膨大期的激素含量均達(dá)最高值，應(yīng)是絞股藍(lán)莖端由正常莖向根狀莖轉(zhuǎn)化的必要階段和關(guān)鍵時(shí)期。其后的變態(tài)芽期均呈下降趨勢(shì)，至莖尖長(zhǎng)出不定根成為根狀莖后，GA和JA仍保持低濃度狀態(tài)，而IAA有所上升。

圖2 絞股藍(lán)莖端暗處理各期的植物激素含量Fig.2 Phytohormone content in stem apex of G.pentaphyllum at three development stages in dark treatment

2.2 絞股藍(lán)莖端糖含量的動(dòng)態(tài)變化

絞股藍(lán)莖端轉(zhuǎn)變不同時(shí)期的糖含量變化如圖3所示。與初始期相比，絞股藍(lán)莖端暗處理后可溶性糖和淀粉含量呈連續(xù)下降趨勢(shì)，在根狀莖期降至最低。蔗糖和果糖則呈平緩上升趨勢(shì)，但幅度極小。還原性糖在黃化膨大期含量較低，但在其后的變態(tài)芽期和根狀莖期呈明顯上升趨勢(shì)。

圖3 絞股藍(lán)莖端暗處理各期的糖含量Fig.3 Sugar content in stem apex of G.pentaphyllum at three development stages in dark treatment

3 討 論

根狀莖作為植物越冬時(shí)的儲(chǔ)存器官，具有碳水化合物、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水的儲(chǔ)藏功能，其發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)進(jìn)程，由不同的內(nèi)源物質(zhì)和環(huán)境因子等誘導(dǎo)發(fā)生。李良俊等[6]發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素在蓮藕根狀莖形成過程中的不同階段具有不同的作用，生長(zhǎng)素在桃枝不定根的發(fā)生中也起著重要促進(jìn)作用[7]。本研究中，絞股藍(lán)根狀莖階段發(fā)育出不定根時(shí)，其他激素含量都呈下降趨勢(shì)，唯有生長(zhǎng)素有所上升，應(yīng)是與其促進(jìn)不定根生成的功能有關(guān)。雙子葉植物種子發(fā)育成幼苗時(shí)，其下胚軸頂端部位的外側(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)素積累較少而生長(zhǎng)快，內(nèi)側(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)素積累較多而生長(zhǎng)慢，從而形成“頂端彎鉤”結(jié)構(gòu)[8]，以使得子葉和頂端分生組織在出土過程中免受土壤帶來(lái)的機(jī)械損傷，保證幼苗正常出土。絞股藍(lán)變態(tài)莖尖鉆入土中后也會(huì)形成彎鉤結(jié)構(gòu)，只不過幼苗是出土而絞股藍(lán)是入土，其原理是相同的。赤霉素也能夠促進(jìn)擬南芥頂端彎鉤的形成[9]，促進(jìn)豌豆黃化苗莖段的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)[10]。在馬鈴薯匍匐莖伸長(zhǎng)過程中、尤其是匍匐莖頂端開始膨脹時(shí)內(nèi)源性赤霉素含量較高[11]，本研究中，絞股藍(lán)赤霉素類在黃化膨大期含量增至最高、且能促進(jìn)變態(tài)芽時(shí)期的彎鉤形成，說(shuō)明赤霉素可能是促成絞股藍(lán)莖端轉(zhuǎn)化的主要調(diào)節(jié)激素。作為重要的植物激素和信號(hào)分子，茉莉酸可以誘導(dǎo)洋蔥儲(chǔ)藏器官的形成和增加儲(chǔ)藏器官的數(shù)量[12]，茉莉酸在調(diào)節(jié)擬南芥暗形態(tài)建成過程中與光信號(hào)通路具有互作關(guān)系，它能在暗中抑制乙烯誘導(dǎo)的擬南芥幼苗頂端彎鉤的形成，抑制下胚軸伸長(zhǎng)并促進(jìn)子葉打開[9,14]。本研究中的絞股藍(lán)茉莉酸含量在變態(tài)芽和根狀莖時(shí)期的含量持續(xù)下降，表現(xiàn)出與幼苗出土的相反功能，以適應(yīng)暗環(huán)境。在暗誘導(dǎo)的絞股藍(lán)莖端轉(zhuǎn)化中，IAA、GA和JA含量均在黃化膨大期明顯上升而后又明顯下降，表明這一時(shí)期可能是根狀莖形成的必要階段和關(guān)鍵時(shí)期。

糖不僅為植物生長(zhǎng)提供物質(zhì)和能量，它也是一種誘導(dǎo)信號(hào)分子，并與其他信號(hào)如植物激素組成復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)體系，其具體的表現(xiàn)形式多為蔗糖或山梨醇，而后在儲(chǔ)藏器官形成中發(fā)揮作用[13]。蔗糖是儲(chǔ)藏器官形成的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，土豆培養(yǎng)基中蔗糖濃度的增加會(huì)導(dǎo)致塊莖數(shù)量增加[15]，40 g/L的蔗糖最利于人參不定根的生長(zhǎng)[16]。本研究絞股藍(lán)莖端的蔗糖含量平緩上升，有助于促進(jìn)不定根的形成。淀粉是儲(chǔ)藏器官的重要成分，是在一系列酶的協(xié)同作用下以蔗糖為起始點(diǎn)催化合成的，是蓮藕根狀莖膨大過程中的重要代謝過程[17]。南荻根狀莖中的淀粉在11月中旬成熟期達(dá)最大值，在5月營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛期具最小值，而可溶性糖含量正好相反，在11月中旬最低，5月最高[18]。絞股藍(lán)莖端在暗誘導(dǎo)形成根狀莖過程中，淀粉含量并沒有增高而是降低，因?yàn)橄募菊墙g股藍(lán)的生長(zhǎng)季，并不利用淀粉積累，可溶性糖也是如此。果糖主要用于根狀莖膨大過程中細(xì)胞的構(gòu)建，以促進(jìn)新器官的形成[19]，在絞股藍(lán)根狀莖的發(fā)育過程中其細(xì)胞數(shù)量和體積均有所增加[5]，所以果糖的供應(yīng)相應(yīng)增加。由于本實(shí)驗(yàn)期較短，糖類含量變化的規(guī)律尚不明顯。

絞股藍(lán)根狀莖的發(fā)育轉(zhuǎn)變與光照尤其是光周期密切相關(guān)。通常短日照能促進(jìn)儲(chǔ)藏器官的形成，葉片可感知光照強(qiáng)度在葉片維管束內(nèi)合成信號(hào)并進(jìn)行傳遞，經(jīng)韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)到營(yíng)養(yǎng)莖尖或匍匐莖尖，從而導(dǎo)致根狀莖等儲(chǔ)藏器官發(fā)生[17]。短日照通過調(diào)節(jié)光周期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白而促進(jìn)儲(chǔ)藏器官的形成，它可使馬鈴薯伸長(zhǎng)的匍匐莖停止生長(zhǎng)，頂端及其下端細(xì)胞通過橫向、隨即分裂使匍匐莖膨大稱為塊莖[20]。極度短日照即趨近于暗誘導(dǎo)，暗誘導(dǎo)涉及包括乙烯和脫落酸在內(nèi)的多種激素、COP/DET/FUS信號(hào)復(fù)合體和PIFs轉(zhuǎn)錄因子等的整合調(diào)控，影響植物生長(zhǎng)發(fā)育[21]。絞股藍(lán)根狀莖的形成也應(yīng)是由短日照引起的，本研究的暗誘導(dǎo)能快速引發(fā)其正常莖端向根狀莖發(fā)育，并伴隨內(nèi)源激素和糖的變化，但其深層的機(jī)理有待研究。同時(shí)，絞股藍(lán)地上莖轉(zhuǎn)化為根狀莖并鉆入土中的現(xiàn)象又是一種向重力性轉(zhuǎn)變。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，幾個(gè)編碼YUCCA、IDD、LAZY 1和ARP 2/3復(fù)合體的向地性基因在絞股藍(lán)莖端轉(zhuǎn)變過程中具有明顯的上調(diào)表達(dá)，使地上莖獲得類似于根的正向地性生長(zhǎng)[22]。此外，參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳水化合物代謝、光周期、苯丙烷生物合成和其他與植物根狀莖發(fā)育相關(guān)的差異表達(dá)基因?qū)?yīng)的miRNA也參與了這一轉(zhuǎn)變。上述基因和miRNA的表達(dá)多數(shù)涉及其對(duì)植物激素的調(diào)控，而植物激素信號(hào)合成途徑又與光暗信號(hào)刺激密切相關(guān)[23]。因此，這提示可從光暗誘導(dǎo)—相關(guān)基因調(diào)控—植物激素合成—根狀莖轉(zhuǎn)化的線索對(duì)絞股藍(lán)的莖端行為進(jìn)行進(jìn)一步研究。