張冰冰, 葉艷英, 周勁松, 湯泳萍, 尹玉玲, 羅紹春
(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所, 南昌 330200)
refine seedlings and transplant
雙邊栝樓(TrichosantheskirirowiiMaxim)俗名吊瓜、藥瓜、野葫蘆等,為葫蘆科栝樓屬的多年生攀緣草質(zhì)藤本植物[1],其果實(shí)(全栝樓)、種子(栝樓籽)、果皮(栝樓皮)及根(天花粉)均可入藥[2]。栝樓具有改善心血管、祛痰止咳、抗腫瘤、降血脂、降血糖、抗?jié)?、抗菌等藥理作用[3]。栝樓籽風(fēng)味獨(dú)特,可食率達(dá)60%[4],入藥或休閑食品的研發(fā)推廣,其保健作用和食用價(jià)值都得到市場(chǎng)的認(rèn)可。近年來,栝樓在農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和助力精準(zhǔn)脫貧中發(fā)揮了巨大作用,產(chǎn)業(yè)前景廣闊。
栝樓屬雌雄異株,種子繁育后代的雌雄株比約為3∶7[4],幼苗期雌雄株無典型性狀差異,直至開花期才能辨別且后代性狀分離嚴(yán)重,種子不宜用于繁育種苗。目前生產(chǎn)上基本采用1~2年生植株當(dāng)年生新根繁育種苗,繁殖系數(shù)低,種根易受病蟲侵害,種性退化嚴(yán)重。利用植物組織培養(yǎng),建立栝樓無性快繁體系,可快速定向繁育出性狀優(yōu)良、基因穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)種苗,彌補(bǔ)種子與塊根繁育的不足,實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)栝樓的市場(chǎng)推廣。阮建等[5]、錢驊等[6]對(duì)其組織培養(yǎng)展開研究,但建立的體系差異較大。筆者選用數(shù)種已建立的栝樓組織體系對(duì)雙邊栝樓皖樓20號(hào)進(jìn)行組織培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)并不適用。究其原因可能與所取材料品種(材料基因型)、生長(zhǎng)年齡或生長(zhǎng)時(shí)期有關(guān)。因此,本研究針對(duì)已建立的栝樓組培快繁體系進(jìn)行適應(yīng)性優(yōu)化,旨在為雙邊栝樓的組培快繁與工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。
試驗(yàn)材料為雙邊栝樓皖樓20號(hào)一年生塊根,2020年2月下旬種植于江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高安創(chuàng)新示范基地(115°E、28°N)。于5—7月份采集生長(zhǎng)健壯的優(yōu)質(zhì)單株帶腋芽莖段為外植體。
1.2.1材料滅菌與接種
取新生幼嫩的栝樓枝條放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室,剪去多余的葉和葉柄,洗潔精清洗浸泡20 min清除灰塵,流水沖洗約30 min,將莖段剪成上下2~3 cm帶芽小段,莖段不宜過短,無菌水沖洗3~4次,用滅菌濾紙吸干水分。于超凈臺(tái)中將其放入無菌培養(yǎng)瓶中,采用4種方式進(jìn)行滅菌(表1),最后用滅菌濾紙吸干水分,接入純MS培養(yǎng)基中,MS培養(yǎng)基添加0.1 g/L的益培靈,抑制微生物的污染。分別于第4天、第7天和第13天統(tǒng)計(jì)污染率。
表1 外植體的不同滅菌方式Table 1 Different methods of sterilization of explants
1.2.2培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件
外植體各時(shí)期誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成(表2),MS+不同種類和水平的激素+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂粉,pH值5.8。高壓滅菌鍋116 ℃滅菌30 min。各時(shí)期培養(yǎng)條件:專用組培室溫度為(25±1)℃,光照時(shí)長(zhǎng)12 h/d,光照強(qiáng)度2 000~3 000 lx。
表2 各時(shí)期外植體組織培養(yǎng)的MS培養(yǎng)基Table 2 MS medium for tissue culture of explants in each period
1.2.3接種與統(tǒng)計(jì)
獲得的無菌外植體接種至初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基,每處理10瓶,每瓶接種3~4個(gè),于第3天、第5天、第7天和第20天觀察并記錄芽誘導(dǎo)情況,并于第20天計(jì)算各處理栝樓外植體的分化系數(shù)。栝樓芽點(diǎn)長(zhǎng)至3~4 cm高時(shí),分剪成帶芽莖段,轉(zhuǎn)接至不同增殖培養(yǎng)基,每處理10瓶,每瓶接種3~4個(gè),20 d后觀察并記錄莖段的增殖情況,篩選最佳增殖培養(yǎng)基。選擇苗高3 cm以上且?guī)в?個(gè)或3個(gè)以上莖間段的無菌苗接種至生根培養(yǎng)基,每處理10瓶,每瓶接種3~4個(gè),觀察并記錄外植體的生長(zhǎng)狀況及生根情況,篩選最佳生根培養(yǎng)基。最后,將根系健壯組培苗瓶蓋打開,放入少許水煉苗2 d,然后洗去根部附著培養(yǎng)基,移栽至混合比為1∶1的蚯蚓土和育苗基質(zhì)的花盆中,放置光照培養(yǎng)箱中并覆蓋白色塑料薄膜,防止水分蒸發(fā)。光照設(shè)置2 400 lx、光照時(shí)長(zhǎng)12 h/d、溫度26 ℃、濕度70%,于第4天緩苗后除去薄膜,7~10 d后,移栽至田地中。
采用WPS軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。相關(guān)指標(biāo)的計(jì)算公式為:
腋芽萌發(fā)率(%)=[萌發(fā)出腋芽(成活)的外植體總數(shù)/接種外植體總數(shù)]×100%;
分化系數(shù)=誘導(dǎo)分化芽點(diǎn)總數(shù)/接種成活外植體初芽點(diǎn)總數(shù);
平均芽點(diǎn)數(shù)=外植體生長(zhǎng)總芽點(diǎn)數(shù)/外植體個(gè)數(shù);
增殖系數(shù)(%)=(芽生長(zhǎng)到可供切割或增殖的外植體數(shù)/接種時(shí)的單芽或單外植體總數(shù))×100%;
生根率(%)=(生根的無菌苗/接種的無菌苗總數(shù))×100%。
于第4天、第7天和第13天分別對(duì)每處理組外植體污染個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并在第13天計(jì)算各處理的污染率(表3)。結(jié)果表明,第4天各處理污染個(gè)數(shù)較少,處理1和處理3無污染外植體,處理2和處理4有細(xì)菌污染。第7天污染外植體顯著增加,增長(zhǎng)率在18%~53%之間,且污染外植體以真菌污染為主,在其基部或莖段有菌絲產(chǎn)生,多以白色孢子為主,個(gè)別有黑色孢子發(fā)生。第13天各處理污染率降低,處理3的污染率降到10%以下。綜合統(tǒng)計(jì)處理2總污染率最高(84%),處理3的污染率最低(26.3%)。所以處理3(75%酒精30 s+無菌水沖洗2~3次+0.1% HgCl210 min+無菌水沖洗3~4次)對(duì)栝樓外植體的滅菌效果最好。
表3 不同滅菌方式外植體污染情況Table 3 Statistical analysis of the contamination of explants in different sterilization methods
將無菌外植體分別接種至1~4號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo),第3天和第5天統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)基褐化外植體總數(shù),第7天統(tǒng)計(jì)死亡和成活總數(shù),第20天統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)芽總數(shù),并計(jì)算分化倍數(shù)。結(jié)果(表4)顯示:低濃度激素組合明顯優(yōu)于高濃度組合,即褐化外植體總數(shù)依次為培養(yǎng)基1號(hào)<2號(hào)<4號(hào)<3號(hào),死亡總數(shù)依次為2號(hào)<1號(hào)<3號(hào)<4號(hào)。第7天發(fā)現(xiàn)各培養(yǎng)基外植體基部均膨大有愈傷產(chǎn)生,高濃度激素組合基部膨大較快且產(chǎn)生愈傷較多,此時(shí)芽點(diǎn)已經(jīng)伸長(zhǎng)。第12天已經(jīng)有節(jié)間段產(chǎn)生,且葉片開始展開(圖1 A、圖1 B)。2號(hào)培養(yǎng)基芽點(diǎn)總數(shù)最多,為57個(gè),4號(hào)同比高濃度激素組合芽點(diǎn)總數(shù)最少,為18個(gè),分化倍數(shù)從大到小依次為2號(hào)、1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)。因此,最佳初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為2號(hào)培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L)。
將上述誘導(dǎo)莖段轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基,第20天隨機(jī)選擇其中3瓶的無菌株,觀察記錄莖段的增殖情況,并計(jì)算平均分化莖段數(shù)(增殖倍數(shù))和平均芽點(diǎn)數(shù)(表5,圖1 C)。6號(hào)培養(yǎng)基莖段增殖倍數(shù)最大(4.75),顯著大于5號(hào)與7號(hào)培養(yǎng)基的增殖倍數(shù),各培養(yǎng)基外植體生長(zhǎng)狀態(tài)詳見表5。因此,栝樓最佳莖段增殖培養(yǎng)基為6號(hào)培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L)。
表5 各培養(yǎng)基莖段增殖統(tǒng)計(jì)與描述Table 5 Statistics and description of stem proliferation of each medium
將無菌莖段分別轉(zhuǎn)接至8~11號(hào)生根培養(yǎng)基,觀察并記錄生根情況(表6,圖1 D、圖1 E)。第4~6天發(fā)現(xiàn)各培養(yǎng)基無菌株基部有少量愈傷產(chǎn)生。9號(hào)培養(yǎng)基第7天栝樓苗開始生根,繼續(xù)培養(yǎng)15 d主根系變長(zhǎng)且粗壯,伴隨有側(cè)根產(chǎn)生,第19~20天觀察根系發(fā)達(dá),組培苗生長(zhǎng)健壯。8號(hào)培養(yǎng)基相對(duì)9號(hào)培養(yǎng)基生根率較低,相差58%,且平均每株生根數(shù)較9號(hào)培養(yǎng)基少2~3條。9號(hào)培養(yǎng)基第7天最先生根,8號(hào)培養(yǎng)基第10天開始有根產(chǎn)生,11號(hào)培養(yǎng)基18 d以后個(gè)別外植體有根產(chǎn)生,截止第20天,10號(hào)培養(yǎng)基無菌株無根系產(chǎn)生,11號(hào)培養(yǎng)基僅2株無菌株生根,其絕大多數(shù)外植體基部膨大凸起,被愈傷包裹,無生根跡象。因此,最佳生根培養(yǎng)基為9號(hào)培養(yǎng)基(MS+ IBA 0.6 mg/L+NAA 0.6 mg/L)。
表6 各培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根統(tǒng)計(jì)與描述Table 6 Statistics and description of induced rooting of each medium
隨機(jī)挑選30株上述生根組培苗,煉苗移栽,截止第15天時(shí)統(tǒng)計(jì)死亡3株,組培苗清洗時(shí)因?yàn)槠淝o稈和根系較脆,清洗掉根死亡1株,成活率為86.7%,成活率較高。
目前外植體常用滅菌劑有75%酒精,0.3%~0.6% NaClO和0.1% HgCl2,選用何種滅菌劑和滅菌時(shí)間由外植體部位及幼嫩程度所決定。一般在徹底殺死表面微生物的同時(shí),又要盡可能減少滅菌劑對(duì)外植體組織和表層細(xì)胞的傷害。本研究選用上述滅菌劑,采用單一滅菌劑對(duì)比交替滅菌的方式,發(fā)現(xiàn)交替滅菌效果(平均總污染率35.7%)明顯優(yōu)于單一滅菌劑的效果(平均總污染率71%)。所以,在實(shí)踐中可以采取交替滅菌和多次滅菌相結(jié)合的方式,以達(dá)到滅除雜菌的目的。本研究發(fā)現(xiàn),使用75%酒精30 s+無菌水沖洗2~3次+0.1% HgCl210 min+無菌水沖洗3~4次效果較好,污染率為26.3%。雖然0.1% HgCl2在建立外植體無菌系中起著重要作用,顯著優(yōu)于其他滅菌劑,但HgCl2附著其外植體表面,無菌水難以徹底清洗干凈,會(huì)對(duì)切口處造成損傷,增加褐化,抑制生長(zhǎng)。因此,在初次修剪時(shí),將莖段剪成上下2~3 cm帶芽小段,方便HgCl2滅菌后剪去切口。其次,HgCl2屬于重金屬離子廢液,對(duì)環(huán)境危害較大[7]。因此,建立效率高、危害小的滅菌體系是現(xiàn)實(shí)所需的。筆者前期采用錢驊等[6]的滅菌方法處理外植體,其除菌效果不太理想,原因可能與采樣環(huán)境、外植體狀態(tài)有關(guān)。種植基地距實(shí)驗(yàn)室較遠(yuǎn),采樣時(shí)均碰上雨天,極大地增加了外植體污染的概率。
在植物組織培養(yǎng)中,植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì),在植物組織培養(yǎng)中起著重要的作用[8]。生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是啟動(dòng)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素。如何平衡兩者種類和比例以控制植物細(xì)胞的發(fā)育方向,是組織培養(yǎng)體系建立的核心。前人研究結(jié)果均表明,6-BA在外植體芽誘導(dǎo)中具有顯著作用。如楊麗娜等[9]指出,MS+6-BA 1.5 mg/L最適合誘導(dǎo)栝蔞腋芽生長(zhǎng);江毅凡[10]指出,在MS+6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L誘導(dǎo)的分化苗質(zhì)量較好;林貴美等[11]研究發(fā)現(xiàn),MS+BA 0.3 mg/L+IBA 0.06 mg/L較適合初代誘導(dǎo)的啟動(dòng)培養(yǎng)。另廖華俊等[12]、曹孟德等[13]、陳惠等[14]都對(duì)其進(jìn)行芽誘導(dǎo)研究,發(fā)現(xiàn)不同的體系激素水平差異較大,如BA濃度均在0.3~2.0 mg/L之間,且激素種類多圍繞BA、IBA和NAA展開。筆者前期采用上述體系對(duì)徽記2號(hào)進(jìn)行無性擴(kuò)繁,發(fā)現(xiàn)各體系外植體誘導(dǎo)情況不佳,第3天出現(xiàn)死亡,于接種第5天絕大部分死亡且褐化程度嚴(yán)重,僅少部分誘導(dǎo)腋芽伸長(zhǎng)。所以筆者設(shè)置4個(gè)相對(duì)低濃度組合進(jìn)行誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)相同6-BA用量條件下組配NAA分化倍數(shù)2.1比IBA分化倍數(shù)1.5更適宜芽的誘導(dǎo),且6-BA的用量增大時(shí),其分化倍數(shù)分別為1.4和1.3,明顯抑制了芽的分化。綜上,最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L。增大激素水平,根據(jù)莖段生長(zhǎng)狀態(tài)篩選增殖培養(yǎng)基,獲得最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L。
IBA和NAA是誘導(dǎo)栝樓無菌株生根的關(guān)鍵激素,獲得健壯根系吸收水分與養(yǎng)分,是最后移栽成活的關(guān)鍵。林貴美等[11]誘導(dǎo)生根為MS+IBA 0.3~0.5 mg/L,楊曉伶等[4]建立生根培養(yǎng)基MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.2 mg/L,錢驊等[6]誘導(dǎo)生根以MS+IBA 0.1 mg/L最好,其次是MS+NAA 0.1 mg/L。余慧琳等[15]、鄭明福等[16]、韓琳娜等[17]對(duì)栝樓組培苗誘導(dǎo)生根都進(jìn)行了相應(yīng)研究,其激素水平絕大部分在0.5 mg/L及以下。筆者對(duì)上述部分體系進(jìn)行生根誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)材料的差異造成體系的不通用性,第25天統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)基生根率在8%以下,生根率極低,部分培養(yǎng)基無根系產(chǎn)生。所以筆者針對(duì)本皖樓20號(hào)增加了各激素的水平,設(shè)置4個(gè)組合對(duì)其生根進(jìn)行誘導(dǎo)。發(fā)現(xiàn)IBA和NAA組合使用時(shí)誘導(dǎo)生根率高,當(dāng)NAA與IBA水平同為0.6 mg/L時(shí)(MS+IBA 0.6 mg/L+NAA 0.6 mg/L),其根系發(fā)生快且健壯,移栽成活率高。
本研究初步建立了雙邊栝樓的組織培養(yǎng)快速繁殖體系,解決了已建立的栝樓組織培養(yǎng)體系對(duì)雙邊栝樓的不適用性,為雙邊栝樓的組培快繁與工廠化規(guī)范生產(chǎn)奠定基礎(chǔ),也可為栝樓屬植物快速繁殖提供技術(shù)參考。