朱立華，劉召陽(yáng)，劉 維，張賢玉，黃麗麗，馮 浩

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊陵 712100)

由子囊菌蘋(píng)果黑腐皮殼(ValsamaliMiyabe et Yamada)引起的蘋(píng)果樹(shù)腐爛病是一種嚴(yán)重影響蘋(píng)果健康生產(chǎn)的重大枝干病害。該病害主要危害果樹(shù)枝干皮層部分，造成樹(shù)皮腐爛壞死，甚至枝枯樹(shù)死[1]。深入解析病菌致病機(jī)理，對(duì)病害防控新策略制定和新技術(shù)研發(fā)具有重要指導(dǎo)意義。

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TFs)是轉(zhuǎn)錄過(guò)程中重要的基因表達(dá)調(diào)控因子。探究蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌侵染過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及功能，有助于深入解析病菌侵染致病機(jī)理。前期研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子在V.mali生長(zhǎng)發(fā)育和侵染致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。VmSeb1缺失突變體的生長(zhǎng)速率和致病力較野生型顯著降低[2]。而轉(zhuǎn)錄因子VmPacC廣泛參與各種生物途徑，特別是V.mali酸化其定殖環(huán)境和致病力所必須的[3]。重要的是，Zn(Ⅱ)2Cys6類轉(zhuǎn)錄因子Vmtf36、Vmtf312、Vmtf1034參與調(diào)節(jié)V.mali的生長(zhǎng)發(fā)育，而Vmtf81參與調(diào)節(jié)病原菌致病力[4]。

鋅指蛋白是指蛋白含有鋅元素且能夠與DNA結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，存在于許多真菌生物中，如稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、構(gòu)巢曲菌(Aspergillusnidulans)、淡紫色擬青霉(Paecilomyceslilacinus)、黃曲霉(Aspergillusflavus)和甲醇酵母(Pichiapastoris)等[5-9]。Macpherson等根據(jù)鋅指結(jié)合基序?qū)\結(jié)合蛋白分為Cys2His2(C2H2)、Cys4(C4)和Cys6(C6)三大類[10]。Zn(Ⅱ)2Cys6鋅指轉(zhuǎn)錄因子的基序?yàn)镃ys-X2-Cys-X6-Cys-X5-12-Cys-X2-Cys-X6-8-Cys，是真菌所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子[8]。

本試驗(yàn)前期通過(guò)RNA-seq技術(shù)對(duì)菌絲體和病菌-蘋(píng)果互作24 h的2組樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)屬于Zn(Ⅱ)2Cys6家族的Vmzctf-07在侵染過(guò)程中穩(wěn)定上調(diào)表達(dá)[11]。然而，Vmzctf-07是否參與V.mali的生長(zhǎng)發(fā)育、非生物脅迫應(yīng)答及致病功能目前尚不明確。為此，本研究首先通過(guò)酵母單雜交和亞細(xì)胞定位對(duì)Vmzctf-07的轉(zhuǎn)錄激活功能和亞細(xì)胞定位進(jìn)行解析，并通過(guò)構(gòu)建其基因缺失和回補(bǔ)突變體探究該基因在病原菌生長(zhǎng)、脅迫應(yīng)答和致病力方面的功能。研究結(jié)果能夠?yàn)樯钊虢馕鎏O(píng)果樹(shù)腐爛病菌Zn(Ⅱ)2Cys6類轉(zhuǎn)錄因子的功能奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株和質(zhì)粒 蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌野生型強(qiáng)致病菌株03-8以及相關(guān)質(zhì)粒pCAMBIA1302-GFP、pGBKT7、pFL2、pDL2等均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病害綜合治理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑 ChamQTM SYBR?qPCR Master Mix試劑盒，phanta max super-fidelity DNA polymerase，ClonExpress Ⅱ one step cloning kit，購(gòu)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；QuickCut限制酶購(gòu)于TAKARA公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京擎科生物科技有限公司；GV3101感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 Tissue lyser-96全自動(dòng)樣品快速研磨儀，上海凈信科技；Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡，OLYMPUS公司；電轉(zhuǎn)化儀，美國(guó)Bio Rad公司；PCR儀，美國(guó)Thermo公司。

1.1.4 引物設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄激活域驗(yàn)證 以病健交界處組織的cDNA為模板，利用Vmzctf07-up-F/R、Vmzctf07-between-F/R、Vmzctf07-down-F/R等引物分別進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。使用QuickCut限制酶NdeI和SalI雙酶切pGBKT7載體，酶切體系及PCR反應(yīng)程序參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。使用ClonExpress Ⅱ one step cloning kit進(jìn)行目的片段與線性化載體的連接。將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，隨后涂布于含有卡那霉素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)16～20 h后挑取單菌落檢測(cè)，并將檢測(cè)正確的單菌落搖菌并提取質(zhì)粒，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

參考YeastmakerTMYeast transformation system 2 User Manual方案制備AH 109酵母感受態(tài)，并進(jìn)行熱激轉(zhuǎn)化，取150 μL酵母菌液涂于SD/Trp培養(yǎng)基平板，3 d后將陽(yáng)性克隆菌株避光點(diǎn)板于含有X-α-gel的SD-Trp-His-Ade的平板，以pGBKT7空載為對(duì)照，30 ℃避光培養(yǎng)3～4 d。

1.2.2 亞細(xì)胞定位觀察 以03-8菌株侵染的蘋(píng)果枝條cDNA為模板，以Vmzctf07-1302-F/R為引物進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。使用QuickCut限制酶NcoI和SpeI雙酶切pCAMBIA1302-GFP載體，參考1.2.1方法構(gòu)建表達(dá)載體。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101并獲得陽(yáng)性克隆農(nóng)桿菌菌液。

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本氏煙瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，以pCAMBIA1302-GFP為對(duì)照，在5 mL含有卡那霉素和利福平抗生素的LB液體培養(yǎng)基中加入100 μL pCAMBIA-1302:Vmzctf-07農(nóng)桿菌菌液，180 r/min，28 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。菌液搖至OD600為0.6時(shí)，6 000 r/min離心5 min，收集菌體，用10 mmol/L的MgCl2溶液洗滌菌體，6 000 r/min離心5 min，重復(fù)2次，隨后用含有終濃度為10 mmol/L的MES緩沖液懸浮菌體，調(diào)節(jié)OD600為0.2～0.6，黑暗靜置3 h。菌液注射于4～5周齡健康煙草葉片背面，注射48 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

圖1 轉(zhuǎn)錄因子Vmzctf-07分段Fig.1 Sequence segmentation of Vmzctf-07

1.2.3 基因缺失突變體構(gòu)建 采用Double-joint PCR技術(shù)構(gòu)建基因敲除載體[12]。以質(zhì)粒pFL2為模板，以EX-G418-F/R為引物擴(kuò)增報(bào)告基因neo；以03-8菌絲DNA為模板，用引物Vmzctf-07-1F/2R與Vmzctf-07-3F/4R擴(kuò)增該基因的up與down片段。將up與down片段與neo片段進(jìn)行連接，構(gòu)建“up-neo-down”基因敲除盒載體并保存在-20 ℃冰箱備用。

參考宋娜等[13]方法制備原生質(zhì)。參照高靜等[14]方法進(jìn)行PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化。以G418作為篩選抗生素，將Vmzctf-07敲除載體轉(zhuǎn)化至03-8的原生質(zhì)體中。

1.2.4 缺失突變體檢測(cè) 以提取轉(zhuǎn)化子DNA為模板，以Vmzctf-07-5F/6R為引物進(jìn)行初篩檢測(cè)，將獲得的候選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，再分別以Vmzctf-07-5F/6R(檢測(cè)目的基因)、G418-F/R(檢測(cè)標(biāo)記基因neo)、Vmzctf-07-7F/G418-R(檢測(cè)上游重組)和G418-F/Vmzctf-07-8R(檢測(cè)下游重組)為4對(duì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，若檢測(cè)候選轉(zhuǎn)化子目的基因片段無(wú)條帶，但抗性片段和兩翼重組片段處出現(xiàn)正確條帶，則表明Vmzctf-07基因被成功敲除。

1.2.5 突變體回補(bǔ) 以野生型03-8菌絲基因組DNA為模板，以HB-Vmzctf-07-F/R為引物擴(kuò)增目的基因和目的基因前1.5 kb的回補(bǔ)片段，使用XhoI酶切pDL2載體，并將回補(bǔ)片段鏈接在pDL2質(zhì)粒上，構(gòu)建回補(bǔ)載體。以Vmzctf-07突變體菌株制備原生質(zhì)，以潮霉素B為篩選抗生素，將回補(bǔ)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)Vmzctf-07突變體的原生質(zhì)。

1.2.6 生長(zhǎng)速率測(cè)定 從活化的野生型03-8、敲除突變體及回補(bǔ)突變體菌落邊緣打取菌餅(Φ=5 mm)，分別接種于PDA固體培養(yǎng)基中，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，2 d后觀察并測(cè)量菌落直徑，使用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)。試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.7 非生物脅迫(NaCl與H2O2)測(cè)定 參考馬晨琛[4]的方法，配置含0.1 mol/L NaCl的PDA固體培養(yǎng)基，用于測(cè)定Vmzctf-07的滲透脅迫。測(cè)定Vmzctf-07的氧化脅迫時(shí)，因H2O2易熱解，需先配置含10 g/L 的PDA培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基溫度降至40～50 ℃后再加入H2O2，使H2O2終濃度為12 mmol/L。以PDA為對(duì)照，按1.2.1方法活化菌株，將各突變體、回補(bǔ)突變體和野生型菌株分別接種在相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基上，按1.2.7方法測(cè)定生長(zhǎng)速率，試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。用SPSS 20.0分析數(shù)據(jù)，按下列公式計(jì)算抑制率：

抑制率={1-[(對(duì)照菌落直徑-5)-(處理菌落直徑-5)]/(對(duì)照菌落直徑-5)}×100%

1.2.8 敲除突變體致病力測(cè)定 參考臧睿等接種方法[15]，將野生型03-8、敲除突變體及回補(bǔ)突變體菌餅(Φ=5 mm)接種于枝條傷口處，黑暗條件下，25 ℃保濕培養(yǎng)，4 d后用手術(shù)刀輕輕刮除病部表皮層，記錄枝條病斑長(zhǎng)度。試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Vmzctf-07轉(zhuǎn)錄激活域驗(yàn)證

利用Vmzctf-07全長(zhǎng)、up、between和down片段分別構(gòu)建pGBKT7重組載體，進(jìn)而利用酵母單雜交技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Vmzctf-07的激活功能。結(jié)果如圖2所示，攜帶Vmzctf-07的down片段和全長(zhǎng)total的AH109酵母轉(zhuǎn)化菌株均能在加有X-α-gel的SD-Trp-His-Ade缺陷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并變藍(lán)，說(shuō)明Vmzctf-07具有轉(zhuǎn)錄激活功能，其轉(zhuǎn)錄激活域可能存在于down區(qū)段。

圖2 Vmzctf-07轉(zhuǎn)錄激活域驗(yàn)證Fig.2 Transcription activation domain verification of Vmzctf-07

2.2 Vmzctf-07亞細(xì)胞定位

在488 mm激發(fā)光波下觀察綠色熒光，結(jié)果如圖3所示，在本氏煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)48 h后，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組pCAMBIA-1302:GFP熒光定位在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上，重組載體菌株pCAMBIA-1302:Vmzctf-07熒光定位于細(xì)胞核。

圖3 Vmzctf-07定位于植物細(xì)胞核Fig.3 Vmzctf-07 is localized in plant cell nucleus

2.3 Vmzctf-07敲除突變體構(gòu)建

利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建Vmzctf-07的缺失突變體。經(jīng)G418抗生素進(jìn)行2次篩選，共獲得1 339個(gè)轉(zhuǎn)化子。如圖4所示，經(jīng)過(guò)5F/6R初步篩選后，利用4對(duì)引物共同檢測(cè)，最終獲得4個(gè)Vmzctf-07敲除突變體，分別命名為Vmzctf-07-87、Vmzctf-07-88、Vmzctf-07-89、Vmzctf-07-91。

注:1為5F/6R引物檢測(cè)；2為G418-F/R引物檢測(cè)；3為7F/G418-R引物檢測(cè)；4為G418-F/8R引物檢測(cè)。圖4 Vmzctf-07敲除突變體PCR檢測(cè)Fig.4 PCR detection of Vmzctf-07 knockout mutant

2.4 Vmzctf-07回補(bǔ)突變體構(gòu)建

選取Vmzctf-07-89、Vmzctf-07-91 2個(gè)敲除突變體進(jìn)行回補(bǔ)試驗(yàn)，用潮霉素B和G418抗生素共同進(jìn)行篩選。檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，以目的基因的5F/6R為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，獲得2個(gè)正確的回補(bǔ)菌株，分別為HB-Vmzctf-07-89和HB-Vmzctf-07-91。

圖5 回補(bǔ)突變體PCR檢測(cè)Fig.5 PCR detection of gene-replenishing mutants

2.5 Vmzctf-07生長(zhǎng)速率測(cè)定

分別將野生型03-8菌株、Vmzctf-07缺失突變體和回補(bǔ)突變體菌株接種于PDA平板上并測(cè)量各自菌落直徑。結(jié)果如圖6所示，與野生型03-8菌株相比，Vmzctf-07敲除突變體的生長(zhǎng)速率下降33.79%，缺失突變體菌株的生長(zhǎng)速率與野生型差異顯著(P=0.05)，而回補(bǔ)突變體與野生型03-8菌株的生長(zhǎng)速率差異不顯著。

圖6 Vmzctf-07突變體生長(zhǎng)速率測(cè)定Fig.6 Growth rate determination of Vmzctf-07 mutants

2.6 非生物脅迫(NaCl與H2O2)測(cè)定

野生型菌株03-8在0.1 mol/L的NaCl脅迫下，生長(zhǎng)速率平均下降48.91%，Vmzctf-07基因缺失突變菌株在0.1 mol/L的NaCl脅迫下生長(zhǎng)抑制率高達(dá)65.86%，相比于野生型，抑制率提高了16.95%，Vmzctf-07基因缺失突變體的抑制率與野生型差異顯著(P=0.05)，基因回補(bǔ)菌株抑制率與野生型差異不顯著(P=0.05)。

野生型菌株03-8在12 mmol/L的H2O2脅迫下，生長(zhǎng)速率平均下降7.06%，Vmzctf-07缺失突變菌株的生長(zhǎng)速率下降25.92%，基因缺失突變體的抑制率與野生型相比差異顯著(P=0.05)，回補(bǔ)菌株與野生型差異不顯著(P=0.05)。

2.7 致病力測(cè)定

通過(guò)接種離體枝條法測(cè)定Vmzctf-07的敲除突變體、回補(bǔ)突變體和野生型菌株的致病力，結(jié)果如圖9所示，Vmzctf-07的4個(gè)敲除突變體菌株的致病力與野生型菌株的致病力差異顯著(P<0.05)，敲除突變體致病力平均下降了36.99%，而回補(bǔ)突變體菌株均恢復(fù)了致病力，與野生型菌株的致病力差異不顯著。

圖7 Vmzctf-07突變體非生物脅迫響應(yīng)測(cè)定Fig.7 Abiotic stress response of Vmzctf-07 mutants

圖8 非生物脅迫對(duì)Vmzctf-07缺失突變體生長(zhǎng)速率分析Fig.8 Analysis of abiotic stress on the growth rate of Vmzctf-07 deletion mutants

圖9 Vmzctf-07突變體致病力測(cè)定Fig.9 Pathogenicity test of Vmzctf-07 mutants

3 結(jié)論與討論

Vmzctf-07具有轉(zhuǎn)錄激活功能，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活功能的區(qū)域可能位于down區(qū)段(aa 1 455～aa 1 644)；Vmzctf-07定位于細(xì)胞核具備轉(zhuǎn)錄因子定位特征；成功構(gòu)建4個(gè)Vmzctf-07缺失突變體(Vmzctf-07-87、Vmzctf-07-88、Vmzctf-07-89、Vmzctf-07-91)和2個(gè)回補(bǔ)菌株(HB-Vmzctf-07-89和HB-Vmzctf-07-91)。分析表明，Vmzctf-07參與調(diào)控V.mali的菌絲生長(zhǎng)、非生物脅迫響應(yīng)和致病過(guò)程。

蘋(píng)果黑腐皮殼菌是一種弱寄生真菌，在侵染寄主時(shí)通過(guò)釋放細(xì)胞壁降解酶、毒素、效應(yīng)蛋白和milRNA等物質(zhì)協(xié)助入侵[16-21]。此外，轉(zhuǎn)錄因子也可參與調(diào)控病原真菌細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，真核生物轉(zhuǎn)錄因子的蛋白結(jié)構(gòu)組成一般包含轉(zhuǎn)錄激活或抑制域(activating domain，AD)和DNA結(jié)合域(DNA binding domain，BD)2個(gè)相對(duì)獨(dú)立的片段及1個(gè)核定位信號(hào)(nuclear localization signal，NLS)[22-23]。AD域一般位于蛋白的C端酸性氨基酸區(qū)、谷氨酸富集區(qū)、N端的絲氨酸-蘇氨酸富集區(qū)和脯氨酸富集區(qū)[24]。轉(zhuǎn)錄因子能與真核生物啟動(dòng)子區(qū)特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，本研究表明Vmzctf-07基因能夠激活下游報(bào)告基因的表達(dá)，具有轉(zhuǎn)錄激活活性，且轉(zhuǎn)錄激活域可能位于蛋白肽鏈的C端(down區(qū)域)，這也為研究該基因的功能和篩選與其互作的蛋白提供了一定基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，Zn(Ⅱ)2Cys6類轉(zhuǎn)錄因子參與真菌的生長(zhǎng)發(fā)育、對(duì)外界的脅迫應(yīng)答、致病性等過(guò)程。Habig等[25]發(fā)現(xiàn)小麥葉枯病菌(Zymoseptoriatritici)中的轉(zhuǎn)錄因子Zt107320影響Z.tritici的生長(zhǎng)。細(xì)葉百合(Liliumpumilum)中轉(zhuǎn)錄因子LpWRKY20參與調(diào)節(jié)百合鱗莖休眠解除進(jìn)程[26]。本研究通過(guò)測(cè)定Vmzctf-07的缺失突變體和回補(bǔ)突變體菌株的生長(zhǎng)速率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vmzctf-07敲除突變菌株生長(zhǎng)速率顯著下降，表明其參與調(diào)控V.mali的生長(zhǎng)發(fā)育，與前人研究結(jié)果一致。蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌轉(zhuǎn)錄因子Vmtf28、Vmtf81、Vmtf315、Vmtf544、Vmtf898、Vmtf1034和Vmtf1049參與V.mali鹽離子脅迫應(yīng)答[4]。姚權(quán)等[27]將果生刺盤(pán)孢菌(Colletotrichumfructicola)中CfHac1基因敲除后，發(fā)現(xiàn)敲除突變體ΔCfhac1對(duì)山梨糖醇和KCl滲透壓脅迫敏感性增加。稻瘟病菌(M.oryzae)中轉(zhuǎn)錄因子的Moapl，具有YAP1轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域，其敲除突變體會(huì)降低對(duì)H2O2的耐受性[28]。李雪等[29]發(fā)現(xiàn)小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici) Zn(Ⅱ)2Cys6類轉(zhuǎn)錄因子PSTG-00514正調(diào)控條銹菌耐高溫脅迫。轉(zhuǎn)錄因子還參與調(diào)節(jié)植物的干旱脅迫，干旱可誘導(dǎo)擬南芥rd29A基因的表達(dá)[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，在0.1 mol/L的NaCl和12 mmol/L的H2O2脅迫下，Vmzctf-07基因缺失突變體與回補(bǔ)突變體相比，生長(zhǎng)速率均顯著下降。綜上，說(shuō)明真菌轉(zhuǎn)錄因子對(duì)多種非生物脅迫有一定的影響。Lu等[32]敲除稻瘟病菌(M.oryzae)中Zn(Ⅱ)2Cys6類轉(zhuǎn)錄因子CNF1和CNF2后，突變體菌株降低了水稻的致病力。此外，Chambers等[33]研究發(fā)現(xiàn)油菜莖基潰瘍病菌(Leptosphaeriamaculan)Zn(Ⅱ)2Cys6類轉(zhuǎn)錄因子ptf1通過(guò)體外傳代過(guò)程中發(fā)生的堿基對(duì)取代從而導(dǎo)致病原菌的致病性減弱。Vmzctf-07缺失突變體對(duì)蘋(píng)果枝條的侵染致病減弱，說(shuō)明其同樣會(huì)參與V.mali的致病過(guò)程。