謝慧英，李娟，于暉，周鴻

江西省疾病預(yù)防控制中心，江西省食源性疾病診斷溯源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330029

烏雞白鳳丸具有補(bǔ)氣養(yǎng)血和調(diào)經(jīng)止帶的功效，是治療婦科疾病的“三大圣藥”之一［1］，收載于《中國藥典》2020 年版一部，其配方主要原材料為烏骨雞，約占制劑用量的25%［2］，烏骨雞的品質(zhì)直接影響烏雞白鳳丸的藥用功效。目前烏骨雞主要以人工養(yǎng)殖為主，在養(yǎng)殖過程中常使用磺胺類藥物抵御病蟲害［3］，不合理用藥會(huì)導(dǎo)致烏骨雞存在藥物殘留［4］，并傳遞到人體，危害人體健康。因此，準(zhǔn)確測定烏雞白鳳丸原料中烏骨雞的藥物殘留，對烏雞白鳳丸的用藥安全有著十分重要的意義。

傳統(tǒng)磺胺類藥物檢測方法有液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等［5-7］，樣品前處理過程相對繁瑣、靈敏度不高、抗干擾能力差，難以滿足23 種磺胺類藥物同時(shí)測定的需要。藥物殘留前處理方法有液液萃取、固相萃取、加速溶劑萃取和分散固相萃取等方法［8-11］。其中分散固相萃取具有快速簡便和高效可靠的特點(diǎn)，在磺胺類藥物分析中已有相關(guān)報(bào)道［12-15］，而在烏骨雞中藥物殘留分析報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)以磺胺類藥物為研究對象，采用碳納米管結(jié)合分散固相萃取，建立了測定烏骨雞中23 種磺胺類藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，以促進(jìn)烏骨白鳳丸藥業(yè)的發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-30A 超高壓液相色譜儀（日本島津公司）；Sciex QTRAP 5500 質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）；高速低溫離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；多孔渦旋振蕩器（德國Heidolph 公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；電子天平（瑞士Metter Toledo）。

23 種磺胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司）；多壁碳納米管（MWCNTs，南京吉倉納米科技有限公司）；無水硫酸鈉、C18 和PSA（天津博納艾杰爾公司）；甲酸、甲醇、乙腈（色譜級，美國Merck 公司）；乙酸銨（色譜級，上海阿拉丁公司）；烏骨雞來源于商場、農(nóng)貿(mào)市場和網(wǎng)店。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

移取適量的23 種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入甲醇配制成5.0 mg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-20 ℃保存；選取空白樣品2.00 g，按“1.3”項(xiàng)下的方法制備空白基質(zhì)提取液，用空白基質(zhì)提取液逐級稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL 的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)系列，于4 ℃保存。

1.3 樣品溶液的制備

稱取2.00 g 樣品于50 mL 離心管中，加入1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸的乙腈10 mL，渦旋振蕩30 min，以8 000 r/min 于4 ℃離心10 min，取出4 mL 上清液，加入100 mg C18、50 mg PSA、20 mg MCNTs和500 mg 無水硫酸鈉，渦旋1 min，以10 000 r/min于4 ℃離心10 min，吸取2 mL 上層清液，氮吹干至近干，加入1 mL 初始流動(dòng)相，復(fù)溶，渦旋混勻1 min，過0.22 μm 濾膜，備用。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

液相色譜條件：BEH C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積為2 μL；流速：0.3 mL/min。流動(dòng)相A：含0.1%（v/v）甲酸的1 mmoL/L 乙酸銨水溶液，流動(dòng)相B：甲醇。梯度洗脫程序:0～1.0 min,10% B；1.0～7.0 min，10% B～45% B；7.0～12.0 min，45% B～95% B；12～14 min，95% B；14.1～16 min，10% B。

質(zhì)譜條件：離子源正離子模式（ESI+）；多反應(yīng)監(jiān)測；氣簾氣：35.0 L/h；霧化氣：50.0 L/h;加熱輔助氣流量：50.0 L/h；離子噴霧電壓：+5 500 V；離子源溫度：500 ℃；其他質(zhì)譜條件見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)待測的磺胺類藥物中，包含相同的母離子和子離子同分異構(gòu)體，這些同分異構(gòu)體需在色譜中分離，避免相互干擾。考慮待測化合物的保留時(shí)間、峰型和質(zhì)譜響應(yīng)等因素，選定含0.1%（v/v）甲酸的1 mmol/L 乙酸銨水溶液-甲醇作為流動(dòng)相體系。在該體系下，磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧達(dá)嗪和磺胺間甲氧嘧啶，磺胺二甲異嘧啶和磺胺二甲嘧啶，磺胺鄰二甲氧嘧啶和磺胺間二甲氧嘧啶，3 組同分異構(gòu)體藥物均實(shí)現(xiàn)了色譜分離。圖1 為3 組同分異構(gòu)體藥物的色譜圖。

圖1 3組同分異構(gòu)體的MRM色譜圖

2.2 提取溶劑和凈化條件的選擇

由于乙腈沉淀蛋白的能力優(yōu)于甲醇和丙酮等常用提取溶劑，選用乙腈為提取溶劑，并加入1%甲酸以提高磺胺類藥物的提取效率［14］。由于烏骨雞中含有大量蛋白質(zhì)、色素和有機(jī)酸等物質(zhì)，如果前處理凈化過程中未除去這些干擾物，將影響目標(biāo)物的定量分析，污染離子源。在樣品中加入C18 可消除脂類的干擾，加入PSA 可除去有機(jī)酸和金屬離子等干擾，加入MCNTs 可去除色素，本實(shí)驗(yàn)將三種材料混合使用以達(dá)到最佳凈化效果。分別考察了不同比例組成的凈化劑對23 種藥物凈化效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選用100 mg C18、50 mg PSA 和20 mg MCNTs 為凈化劑能達(dá)到凈化目的。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)、檢出限、定量限及加標(biāo)回收率

采用基質(zhì)曲線標(biāo)準(zhǔn)溶液與溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液中磺胺類藥物的響應(yīng)百分比減去100 的差值來評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果為負(fù)值表現(xiàn)為基質(zhì)抑制，反之，則表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)［15］。結(jié)果表明，大部分磺胺類藥物表現(xiàn)為弱抑制基質(zhì)效應(yīng)，而磺胺吡啶和磺胺嘧啶的基質(zhì)效應(yīng)抑制較大，見表2。為了保證方法的準(zhǔn)確性，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，制備空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線以減少基質(zhì)效應(yīng)影響，圖2 為空白基質(zhì)中的23 種磺胺類藥物的總離子流圖。

表2 23種磺胺類藥物的基質(zhì)效應(yīng)、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率與精密度

表2 （續(xù)）

23 種磺胺類藥物在1.0～50 ng/mL 的線性范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系，同時(shí)在空白樣品中添加低水平23 種藥物，分別以3 倍和10 倍信噪比對應(yīng)的濃度來確定檢出限和定量限。23 種磺胺類藥物的檢出限均≤0.58 μg/kg，定量限均≤1.91 μg/kg。

取50 ng/mL 的23 種磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，進(jìn)樣6 次，比較定量離子峰面積，統(tǒng)計(jì)各種目標(biāo)物峰面積，峰面積的RSD 為0.42%～5.2%。在空白樣品中進(jìn)行3 個(gè)水平（1.0、5.0和10 μg/kg）的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，23 種藥物平均加標(biāo)回收率為74.8%～106.0%，RSD（n=6）為3.1%～9.8%。

2.4 實(shí)際樣品測定

采用本實(shí)驗(yàn)方法對10 批次烏骨雞樣品進(jìn)行監(jiān)測，1 批次烏骨雞檢出磺胺甲氧嘧啶（0.96 μg/kg），但未超過國家限量標(biāo)準(zhǔn)（農(nóng)業(yè)部235 公告），其余樣品均未檢出目標(biāo)物。

3 結(jié)論

基于分散固相萃取技術(shù)，以酸化乙腈為提取劑，C18、PSA 和MCNTs 為混合凈化劑，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，建立了烏骨雞中23 種磺胺類藥物殘留的分析方法。本方法操作簡便、快速、高效，靈敏度高且成本低廉，通過方法學(xué)驗(yàn)證，準(zhǔn)確性、重復(fù)性、檢出限和定量限均能滿足烏骨雞中的23 種磺胺類藥物殘留分析要求。為烏骨雞中藥物殘留監(jiān)控提供技術(shù)支持，對進(jìn)一步保障烏骨白鳳丸藥業(yè)質(zhì)量安全具有現(xiàn)實(shí)意義。