王麗紅 陳潔琳 閆勇杰 王 超 周 奇

（1. 佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2. 高密市人民醫(yī)院，山東 高密 261599）

胡桃楸（Juglans mandshuricaMaxim.）的果實青皮可入藥使用，名為北青龍衣（JM）[1]?！吨腥A本草》和《中藥辭?！酚涊d，JM味苦性寒，具有清熱、解毒、消腫、止痢、明目等功效[2-3]。JM在產(chǎn)地山區(qū)民間應(yīng)用廣泛，常將之泡茶或泡酒飲用，以用于治療胃炎、胃痛、消化道癌癥、細(xì)菌性痢疾、腸炎等疾病，且治療效果顯著[4-7]。此外，將胡桃楸鮮果皮搗汁外涂，在治療上火頭痛和神經(jīng)性皮炎方面也有不錯療效[8]。傳統(tǒng)生藥學(xué)鑒定中最重要的方法之一是性狀鑒定。隨著產(chǎn)地和采收期的變化，僅僅依靠性狀鑒定很難對同一品種的藥材進(jìn)行區(qū)分[9]。高效液相色譜（HPLC）法能快速地測定藥材某一指標(biāo)成分的含量[10-11]。近年來，雖然有學(xué)者從性狀和顯微方面對JM進(jìn)行了初步的生藥學(xué)鑒定，但無文獻(xiàn)對其藥材道地產(chǎn)地及最佳采收期進(jìn)行報道，其藥材的質(zhì)量分析評價也缺乏依據(jù)[12-13]。

因此，本研究將對不同產(chǎn)地和采收期的JM進(jìn)行生藥學(xué)研究，通過對不同產(chǎn)地和采收期JM的藥材質(zhì)量進(jìn)行評價，得出JM優(yōu)質(zhì)的道地產(chǎn)區(qū)及最佳采收期，為北青龍衣道地藥材的質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用藥材采自2016年7、8、9月，經(jīng)鑒定均為胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans）胡桃楸（Juglans mandshuricaMaxim.）的未成熟果實的干燥外果皮。藥材的產(chǎn)地、采收期及編號見表1。外果皮剝下經(jīng)35 ℃烘干48 h，粉碎機(jī)粉碎后過0.25 mm網(wǎng)篩備用。

表1 JM產(chǎn)地和采收期信息Tab.1 Information of origins and harvest times in JM

胡桃醌對照品（純度≥98%），河南省標(biāo)物生物科技有限公司；無水乙醇、乙醚、甲醇、磷酸均為分析純；甲醇為色譜純；水合氯醛、甘油均為化學(xué)純。

1.2 設(shè)備

生物顯微鏡（CX-33），日本奧林巴斯株式會社；雙目解剖體視顯微鏡（XTS20-314A），北京泰克儀器有限公司；紫外可見分光度計（UV757），上海精密科學(xué)儀器有限公司；臺式低速離心機(jī)（80-2），上海亞榮生化儀器廠；高效液相色譜儀（Agilent 1100 Series）、色譜柱（EclipseXDB-C18）、DAD檢測器，美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 理化鑒定

1）樣品溶液的制備：稱取JM粉末2.00 g，加入90%乙醇30 mL，在30 ℃、300 W條件下超聲提取40 min，過濾后3 500 r/min離心15 min，取上清液定容到10 mL容量瓶中[14-15]。在進(jìn)樣前用0.45 μm微孔濾膜過濾。

2）色譜條件：色譜柱為EclipseXDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶水（55∶45），水相用磷酸（約0.1%）調(diào)pH為3.60；流速為1 mL/min；檢測波長為248 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量為10 μL[16-17]。

3）標(biāo)準(zhǔn)曲線確定：精密稱量適量胡桃醌對照品，溶于甲醇，配制濃度分別為5.09、10.18、25.45、50.9、101.8、203.6 μg/mL的對照品溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，以胡桃醌濃度（X）和峰面積（Y）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

4）精密度測試：精密吸取25.45 μg/mL胡桃醌對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5 次，記錄每一次進(jìn)樣得出的峰面積，計算RSD值。

5）穩(wěn)定性測試：精密吸取同一樣品溶液，分別在0、3、6、12、24 h進(jìn)樣，測定其峰面積，計算RSD值[18]。

6）重復(fù)性測試：按樣品處理方法制備5 份7 號樣品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5 次，測定峰面積，計算RSD值。

7）加樣回收率測試：精密量取5.75 μg/mL的7 號樣品溶液6 份，每份4 mL分別置于10 mL容量瓶中，依次加入1、2、3、4、5、6 mL濃度為20 μg/mL的對照品溶液，并用甲醇分別定容至刻度線，按上述色譜條件進(jìn)行胡桃醌含量，計算平均回收率和RSD值。

1.3.2 性狀鑒定

采用直觀觀察法觀察1～9 號JM，觀察其形狀、色澤、質(zhì)地、表面特征等；嗅聞其氣味等；用尺測量其大??；采用水試（將JM浸泡于25 ℃水中0.5 h后觀察溶液顏色）方法進(jìn)行其他性狀特征的觀察，記錄各數(shù)據(jù)，并進(jìn)行對比[19-20]。

1.3.3 顯微鑒定

取胡桃醌含量最高的樣品，按常規(guī)石蠟切片法制作切片，番紅50 %乙醇溶液-固綠95 %乙醇溶液染色，加拿大樹膠封固[21-23]；取少量JM粉末，滴加1～2 滴水合氯醛透化制作臨時裝片[9]。每個樣品制作切片30～50份[24]。置于顯微鏡下觀察顯微特征，并用顯微量尺測量大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化鑒定結(jié)果

2.1.1 方法學(xué)考察結(jié)果

胡桃醌回歸方程Y=38.10X-172.6，r=0.999 1，表明胡桃醌的峰面積在5.09～203.6 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率的RSD值分別為2.01%、1.14%、1.89%、99.39%，表明儀器精密度良好、樣品溶液于24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好、此方法重現(xiàn)性良好且準(zhǔn)確度較高。

2.1.2 不同JM胡桃醌的含量比較

同產(chǎn)地JM中胡桃醌含量均為9月?8月?7月；同采收期JM中胡桃醌含量為黑龍江產(chǎn)地?吉林產(chǎn)地?遼寧 產(chǎn)地（表2）。

表2 不同產(chǎn)地和采收期JM的胡桃醌含量比較Tab.2 Comparison of juglone content in JM from different regions and harvest times

2.2 性狀鑒定結(jié)果

不同JM的性狀特征如表3所示。黑龍江省產(chǎn)的JM果皮較吉林、遼寧大，外表面、毛茸和水試溶液顏色最深，質(zhì)地硬而脆，口嘗有辛辣感；吉林省產(chǎn)的外表面顏色偏黃，內(nèi)表面可見脊棱線，質(zhì)地堅韌，口嘗發(fā)澀；遼寧省產(chǎn)的外表面顏色偏綠，毛茸和水試溶液顏色最淺，內(nèi)表面可見脊棱線和黃色近粉末狀物質(zhì)，質(zhì)地堅硬。

表3 不同JM的性狀特征比較Tab.3 Comparison of macroscopical characteristics of different JM

2.3 顯微鑒定結(jié)果

2.3.1 組織構(gòu)造

JM組織特征如圖1和2所示。外果皮為一列厚度為9～15 μm的細(xì)小類圓形表皮細(xì)胞，外被角質(zhì)層，厚度6～9 μm，密生腺毛和非腺毛。腺毛頭部由4～5個細(xì)胞組成，腺柄由5～7個細(xì)胞組成；非腺毛呈分枝狀。氣孔突出于表皮。中果皮較厚，厚度達(dá)1 200～2 300 μm，中果皮外側(cè)的數(shù)列細(xì)胞，類圓形，細(xì)跑壁增厚，排列緊密；其他細(xì)胞多為類圓形薄壁細(xì)胞，薄壁細(xì)胞中含顆粒狀葉綠體，偶見細(xì)小的草酸鈣方晶。在中果皮的薄壁組織中可見外韌型維管束及散在的分泌細(xì)胞。中果皮再向內(nèi)常有2～3列石細(xì)胞組成的石細(xì)胞環(huán)帶。石細(xì)胞各異，有類圓形、橢圓形、多角形等。

圖1 JM橫切面部分詳圖（10×40）Fig.1 Partial detail of transverse section of JM (10×40)

圖2 JM組織構(gòu)造部分簡圖（10×10）Fig.2 Partial sketch of transverse section of JM (10×10)

圖3 JM粉末特征圖（10×40）Fig.3 JM powder characteristic diagram (10×40)

2.3.2 粉末特征

不同產(chǎn)地和采收期JM粉末特征如圖3所示，特征信息統(tǒng)計表見表4，粉末特征大小統(tǒng)計見表5，粉末特征數(shù)量統(tǒng)計如圖4所示。黑龍江省產(chǎn)的1號非腺毛、分泌腔最多；3號的石細(xì)胞最大，分泌細(xì)胞數(shù)量最多。吉林省產(chǎn)的石細(xì)胞較小，而6號腺毛最長，但數(shù)量微少。遼寧省產(chǎn)的8號石細(xì)胞數(shù)量最多，但較小；9號非腺毛較其他產(chǎn)地長，但非腺毛數(shù)量最少。各產(chǎn)地和采收期粉末的顯微特征數(shù)量上各有所長，但隨果實生長發(fā)育，3個產(chǎn)地的粉末特征大小均呈遞增趨勢。

圖4 JM粉末特征數(shù)量統(tǒng)計圖Fig.4 Quantitative statistical chart of JM powder characteristics

表4 不同產(chǎn)地和采收期JM的粉末特征統(tǒng)計表Tab.4 Statistical table of powder characteristics of JM in different origins and harvest times

表5 JM粉末特征大小統(tǒng)計表Tab.5 Statistical table of JM powder characteristic size

3 結(jié)論

胡桃醌為5-羥基-1,4-萘醌，屬萘醌類化合物，具有止血、抗菌、抗腫瘤和抗病毒等活性[25-26]。胡桃醌作為北青龍衣的重要化學(xué)成分，其含量可作為篩選北青龍衣最佳產(chǎn)地和采收期的主要依據(jù)。

本研究表明，黑龍江省9月中下旬采收的北青龍衣含量最高，達(dá)203.476 μg/g。各產(chǎn)地和采收期北青龍衣的組織構(gòu)造特征差異不大。黑龍江省9月中下旬采收的北青龍衣的性狀鑒別點是果皮直徑4.2～6.3 cm，外表面黑褐色，毛茸棕黃色，質(zhì)地硬而脆，味辛，水試溶液棕黑色；粉末特征鑒別點是薄壁細(xì)胞排列緊密且內(nèi)含液泡，石細(xì)胞壁增厚、腔內(nèi)呈淺棕色、紋孔呈分枝狀及層紋不明顯，腺毛長直且顏色較深，分泌組織散在。