葛俊偉, 李平, 張童童, 高飛, 王文越, 王鈞楠， 孫稚穎*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355; 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488)

為摸清中藥資源家底，確保我國中醫(yī)藥事業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，從2011年起，全國各地陸續(xù)開展了第四次中藥資源普查工作[1]。本課題組在山東省滕州市野外進行資源普查的過程中，發(fā)現(xiàn)了一種野生唇形科植物。通過形態(tài)觀察，判斷其為香茶菜屬(Isodon(Schrad. ex Benth.) Spach)植物，并且該植物與有山東分布記錄的香茶菜屬內(nèi)折香茶菜(Isodoninflexus(Thunb.) Kudo)較為相似，但也有差異，如雄蕊、花柱伸出，而內(nèi)折香茶菜雄蕊、花柱內(nèi)藏。進一步鑒定發(fā)現(xiàn)該植物與無山東分布記錄的碎米椏(I.rubescens(Hemsl.) Hara)更為相似。香茶菜屬為唇形科植物，木本或草本；根莖常肥大木質(zhì)，葉具齒。聚傘花序，花具梗[2]。屬內(nèi)多種植物入藥，如碎米椏，《中國藥典》收載，其干燥地上部分作冬凌草入藥，具有清熱解毒、活血止痛功效[3]，對多種癌癥的癥狀有緩解作用[4]。此外，內(nèi)折香茶菜也有抗腫瘤作用[5]。在野外僅憑宏觀特征無法準(zhǔn)確判斷該未知植物物種，因此有必要進行更深入的鑒定研究，從而為新資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

DNA條形碼技術(shù)能實現(xiàn)對中藥材方便快捷的鑒定。核ITS2序列與葉綠體psbA-trnH序列作為DNA條形碼現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于藥用植物資源鑒定，并被收錄于2015版和2020版《中國藥典》第四部[6-7]，而且前人也做了大量研究，如psbA-trnH序列在薯蕷屬[8]、沉香屬[9]等中藥材的物種鑒定中的作用已得到證實，ITS2序列在板藍根[10]、白前[11]、烏頭屬[12]等中藥材的物種鑒定中同樣得到很好的應(yīng)用。

因此，本研究將利用核基因組ITS2片段以及葉綠體基因組psbA-trnH基因間隔區(qū)作為DNA條形碼序列，對所調(diào)查物種進行分子鑒定，同時從GenBank下載相關(guān)可靠序列進行比對分析，旨在對所發(fā)現(xiàn)的這一野生植物進行準(zhǔn)確的物種鑒定，進而為其資源開發(fā)利用等相關(guān)研究提供證據(jù)。

1 材料、試劑與方法

1.1 實驗材料

所研究植物樣品(wz)采自山東省滕州市濱湖鎮(zhèn)雙井村東南山坡，拍照觀察，經(jīng)初步外部形態(tài)觀察后，單株取樣，隨機取3份不同植株個體幼嫩葉片(wz1，wz2，wz3)，硅膠干燥備用。憑證標(biāo)本保存于山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥系標(biāo)本室(標(biāo)本號為：370481181013001LY)。

1.2 試劑與儀器

試劑主要包括：GeneRed核酸染料；2×Taq PCR MasterMIX(含染料)；5×TBE Buffer；DL2000 marker；植物基因組DNA提取試劑盒(天根生物技術(shù)(北京)有限公司)等。

儀器主要包括：SYG-2恒溫水浴鍋(常州朗越儀器制造有限公司)；1-14高速離心機(德國SIGMA公司)；DYY-8B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；T100 Thermal Cycler熱循環(huán)儀(美國Bio-rad公司)；LUMINESCENT Amersham Imager 600圖像分析儀(瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB公司)；XFS-280CB手提式壓力蒸汽滅菌鍋(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司)；303-OB電熱恒溫培養(yǎng)箱(紹興市滬越儀器設(shè)備廠)等。

1.3 方法

1.3.1 總DNA的提取

取干燥葉片約30 mg，于研缽內(nèi)加液氮迅速研磨，用植物基因組DNA提取試劑盒參照說明書方法提取材料總DNA，，置于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2 PCR擴增及測序

PCR擴增體系為25.0 μL：包括DNA模板2.0 μL，雙向引物各1.0 μL(濃度2.5 μmol/L)，2×Taq PCR MasterMIX12.5 μL，雙蒸水(約8.5 μL)補足至25 μL。PCR擴增反應(yīng)條件及擴增實驗程序參考2015版、2020版《中國藥典》第四部等的研究方法[6-7,13]。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，切膠純化，使用ABI 3730XL測序儀雙向測序。

PCR擴增及測序引物信息見表 1。

表1 引物信息Table 1 Information on primers

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

所得序列利用軟件Chromasv校對拼接，對于核序列，切除兩端5.8S和28S堿基序列得到樣品的ITS2序列；對于葉綠體序列，切除兩端引物序列，得到psbA-trnH序列，NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站進行Blast比對，并分別下載相關(guān)物種的ITS2和psbA-trnH序列，然后用軟件MEGA6.0進行數(shù)據(jù)分析，并利用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建距離樹[14-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物外部形態(tài)觀察

木質(zhì)根；葉對生，卵圓形，先端漸尖，基部楔形，驟然漸狹下延，邊緣具鋸齒，葉膜質(zhì)，上下表面被柔毛至近無毛；唇形花冠，紅至紫色，雄蕊4，伸出，花柱伸出；花盤環(huán)狀。

依據(jù)外部形態(tài)觀察，初步推斷所調(diào)查物種與內(nèi)折香茶菜相似，與《中國植物志》英文版FloraofChina[2]中碎米椏形態(tài)更為吻合。

注：箭頭示主要鑒別特征。圖1 植物形態(tài)圖Fig.1 Morphology of the studied species

2.2 基因序列分析

2.2.1 ITS2序列

為了更好地確定該物種，從GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)下載了幾條碎米椏與內(nèi)折香茶菜ITS2序列以作比較分析。通過分析發(fā)現(xiàn)，所測3株植物樣品ITS2堿基序列長度均為212 bp，GC含量為67.9%，3株植物個體堿基序列完全一致。與GenBank中所下載的碎米椏(Sequence ID:KF032250、KT285125、JQ389511、JQ389509)序列比對也無差異，與內(nèi)折香茶菜(Sequence ID:KF032264、KF032265、KF032266)有7個位點差異，見表 2。同時經(jīng)NCBI網(wǎng)站上Blast比對，本實驗所研究樣品與碎米椏的相似度為100%，構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹見圖2。可明顯看出，所研究樣品(wz1，wz2，wz3)與GenBank所下載碎米椏聚在一支。

表2 所研究植物樣品的ITS2差異位點信息Table 2 Information on different ITS2 loci in the studied samples

圖2 基于ITS2序列構(gòu)建NJ距離樹Fig.2 Phylogenetic tree construction based on ITS2 sequences using the NJ method

2.2.2psbA-trnH序列

為了更好地鑒定該物種，從GenBank下載了內(nèi)折香茶菜和碎米椏psbA-trnH序列，通過對實驗結(jié)果分析，所測3株不同個體樣品堿基序列長度均為391 bp，GC含量為29.7%，居群內(nèi)個體間堿基序列無差異。與GenBank所下載序列比較，差異位點信息見表3。

表3 所研究植物樣品的psbA-trnH差異位點信息Table 3 Information on different psbA-trnH loci in the studied samples

其中KF855542兩端堿基序列不完整，根據(jù)Kimura 2-Parameter (K2P)遺傳距離分析得出，樣品與GenBank中提交的碎米椏(Sequence ID:FJ513119、KF855542)差異較小，遺傳距離為0.003～0.005；與內(nèi)折香茶菜(Sequence ID:FJ513099、KF032288)差異較大，遺傳距離為0.026～0.027。利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹見圖3，可以看出該研究物種與碎米椏聚在一支。

圖3 基于psbA-trnH序列構(gòu)建NJ距離樹Fig.3 Phylogenetic tree construction based on psbA-trnH sequences using the NJ method

3 討論

本研究利用DNA條形碼技術(shù)對野外資源調(diào)查中所發(fā)現(xiàn)的形態(tài)鑒定不確定物種進行了分子鑒定，所采用的方法便捷、可靠，減少了客觀環(huán)境與主觀因素造成的誤差，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。DNA條形碼分別使用了核基因組ITS2序列與葉綠體基因組psbA-trnH序列。此外，從GenBank所下載作對比分析的序列均經(jīng)過嚴格篩選溯源，保證其來源的準(zhǔn)確性和可靠性，如KF855542來自中科院西雙版納植物園Yu等[16]發(fā)表在MolecularPhylogeneticsandEvolution上的文章，該文從系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和生物地理學(xué)角度研究了香茶菜屬植物的快速輻射進化。JQ389511、JQ389509樣品采自中國河南省北部，論文發(fā)表在PLoSOne，作者采用系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和居群遺傳學(xué)相結(jié)合的方式篩選中國香茶菜屬植物中冬凌草甲素含量豐富的物種資源，研究結(jié)果表明河南省所產(chǎn)碎米椏和毛葉香茶菜可以提供最好的冬凌草甲素來源[17]。KF032288、KF032250、KF032264、KF032265、KF032266來自夏至等[18]發(fā)表在《中草藥》上的文章，該文對碎米椏及其近緣種進行了分子鑒定，研究結(jié)果表明，碎米椏與毛葉香茶菜、香茶菜和內(nèi)折香茶菜親緣關(guān)系較近，ITS和psbA-trnH 序列可以準(zhǔn)確鑒別碎米椏及其近緣種。其余三條序列均來自Chen等[19]和向麗等[20]所提交序列。

通過DNA條形碼核基因組ITS2序列與葉綠體基因組psbA-trnH序列分析結(jié)果可以佐證作者野外形態(tài)觀察推論，判斷所研究樣品應(yīng)該為碎米椏。本研究結(jié)果支持夏至等所發(fā)表文章觀點。但這兩種序列也有所差異，相比較而言，針對該物種，核基因組ITS2序列比葉綠體基因組psbA-trnH基因間隔區(qū)序列分辨力更高。差異主要是由于核基因來自雙親遺傳，而葉綠體基因是母系遺傳。

本實驗研究材料采自山東省滕州市，為全國第四次中藥資源普查中所發(fā)現(xiàn)，后在調(diào)查濟南市長清區(qū)中藥資源時，在靈巖山附近也有發(fā)現(xiàn)，根據(jù)實驗結(jié)果可知此香茶菜屬資源植物為碎米椏，而《山東植物志》《山東植物精要》《山東藥用植物志》等均沒有收載該物種[21-23]，也未見相關(guān)文獻報道其在山東有分布，因此認為碎米椏是山東境內(nèi)新分布種。這一結(jié)論有助于補充和完善山東省的中藥資源數(shù)據(jù)庫，同時作為具有抗癌等多種活性的藥用植物資源，碎米椏在山東省的分布與發(fā)現(xiàn)，對該資源的開發(fā)和可持續(xù)利用具有重要意義。