祝曉麗，高家榮,2*，施苗苗，秦秀娟，魏良兵，劉濤，張魏

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

慢性腎小球腎炎(chronic glomerulonephritis ，CGN)屬于中醫(yī)“水腫”“尿血”“腰痛”等范疇[1]，具有起病隱匿、遷延不愈、預(yù)后差等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，是臨床研究的重點(diǎn)[2]。CGN是腎小球硬化和終末期腎病的最常見原因，常導(dǎo)致患者出現(xiàn)蛋白尿、血尿[3]。本病早中期無明確、有效的治療方法，應(yīng)用西藥有一定的治療作用，但經(jīng)常出現(xiàn)不良反應(yīng)且治療作用有限。中醫(yī)藥在CGN治療上優(yōu)點(diǎn)顯著，可改善患者臨床癥狀、減輕反跳現(xiàn)象，保護(hù)腎臟功能及延緩腎病進(jìn)展[4-6]。黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，書中謂其味甘，微溫，可升可降，陽中之陽也，具有大補(bǔ)元?dú)?、健脾補(bǔ)腎、利水消腫的作用，乃補(bǔ)氣之圣藥，常用來治療各種腎臟疾病[7]。研究表明，黃芪可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，提高血漿蛋白水平，促進(jìn)尿鈉排泄，改善機(jī)體水液代謝，消除水腫，緩解癥狀[8-10]，減少腎臟組織的損害。白茅根具有清熱利尿，利水消腫，導(dǎo)熱下行的功效[11]。陳蘭英等[12]以阿霉素造模，構(gòu)建大鼠模型，以白茅根的不同提取物為研究內(nèi)容，發(fā)現(xiàn)其對模型大鼠有不同程度的保護(hù)作用，并且其作用機(jī)制可能是通過降低TGF-β1以及NF-κB p65的表達(dá)，抑制TNF-α的活性，進(jìn)而改善阿霉素腎病大鼠腎組織病變。黃芪健脾益氣，白茅根清熱利尿，二藥配伍，扶正祛邪，標(biāo)本兼治，共奏健脾益氣、清熱利濕之功。黃芪得白茅根，固表而不致留邪；白茅根得黃芪，祛邪而不傷正，補(bǔ)中寓疏，散中寓補(bǔ)，內(nèi)外兼顧。但是，黃芪-白茅根在CGN治療中的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究借助可視化工具，初步對黃芪-白茅根在CGN治療中的作用進(jìn)行探討，為臨床治療CGN提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黃芪、白茅根的活性成分及CGN靶點(diǎn)的篩選

應(yīng)用BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、TCMSP(https://tcmsp-e.com/)檢索黃芪和白茅根相關(guān)的成分，為獲得黃芪、白茅根的活性成分，將口服生物利用度OB ≥30%以及類藥性DL ≥0.18 設(shè)為篩選條件[13-16]。通過SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)和Uniprot(http://www.uniprot.org/)獲取活性成分的靶點(diǎn)信息[17-18]。關(guān)鍵詞為“chronic glomerulonephritis”，使用GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/) 、DisGeNET(https://www.disgenet.org/) 、Drugbank(https://go.drugbank.com/) 、DiGSeE(http://210.107.182.61/geneSearch/)數(shù)據(jù)庫收集CGN疾病靶點(diǎn)[19-23]。

1.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為明確黃芪-白茅根與CGN潛在靶點(diǎn)間的相互作用，利用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將藥物與CGN疾病靶點(diǎn)取交集，獲得潛在交集靶點(diǎn)。應(yīng)用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建核心成分-靶點(diǎn)、藥物-活性成分-交集靶點(diǎn)-疾病以及靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。本文中藥物為黃芪與白茅根，核心成分是指在活性成分篩選出來的基礎(chǔ)之上，應(yīng)用Cytoscape3.7.1軟件“Network Analyzer”功能，以網(wǎng)絡(luò)整體的節(jié)點(diǎn)度值(degree)、介數(shù)中心性(betweenness centrality，BC)以及接近中心性(closeness centrality，CC)3個(gè)重要拓?fù)鋮?shù)的中位數(shù)為篩選條件，篩選出來的成分。

1.3 核心蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將活性成分和疾病的交集靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/ )[24]，獲取蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用( protein-protein interaction， PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。應(yīng)用Cytoscape3.7.1軟件“Network Analyzer”功能，分別以degree、BC、CC中位數(shù)為條件，篩選核心靶點(diǎn)，設(shè)置網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺反映degree值大小[25]。

1.4 GO和KEGG分析

將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Omicshare(https://www.omicshare.com/)平臺，物種設(shè)置為人類，進(jìn)行基因本體( gene ontology， GO)(http://geneontology.org/)分析(P<0.05)，并分別篩出前20個(gè)功能類別構(gòu)建圈圖，GO相關(guān)條形圖由軟件R 4.1.0完成。對靶蛋白進(jìn)行京都基因與基因組百科全書( Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)(https://www.kegg.jp/)富集分析(P<0.05)，選擇前20條KEGG通路構(gòu)建圈圖。

1.5 分子對接

應(yīng)用AutoDock Vina以及LigPlot軟件進(jìn)行分子對接。結(jié)合能 ≤ 0 kJ/mol表明該化合物能與靶結(jié)合并相互作用，而結(jié)合能≤-20.93 kJ/mol表明表現(xiàn)出很強(qiáng)的結(jié)合力[26]。

2結(jié)果與分析

2.1 黃芪-白茅根活性成分及靶點(diǎn)篩選

從BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索到黃芪35個(gè)成分，白茅根7個(gè)成分；TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到黃芪87個(gè)成分，白茅根33個(gè)成分。依據(jù)條件，共篩選出26個(gè)活性成分，其中黃芪22個(gè)，白茅根3個(gè)，1個(gè)為兩者共有，主要成分見表1(全表見OSID附表1)。利用SwissTargetPrediction和Uniprot兩個(gè)數(shù)據(jù)庫獲得271個(gè)活性成分靶點(diǎn)，其中黃芪有263個(gè)，白茅根有52個(gè)，44個(gè)為兩者共有，按照degree、BC、CC中位數(shù)為篩選條件獲得14個(gè)核心成分，并將獲得信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1，構(gòu)建核心成分-活性靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，藍(lán)色三角形為成分，黃色為活性成分靶點(diǎn)，見圖1。

表1 黃芪-白茅根部分主要活性成分篩選結(jié)果Table 1 Screening results of part of the active components of Astragali Radix-Imperatae Rhizomain

注：藍(lán)色三角形為核心成分，黃色為相對應(yīng)的靶點(diǎn)。圖1 核心成分-活性靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Core component-active target interaction network

2.2 黃芪-白茅根靶點(diǎn)與CGN靶點(diǎn)的交集分析

通過GeneCards、OMIM、DisGeNET、Drugbank、DiGSeE數(shù)據(jù)庫獲得2 360個(gè)CGN相關(guān)靶點(diǎn)，利用Venny將活性成分與疾病靶點(diǎn)取交集，獲得143個(gè)交集靶點(diǎn)，上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，去除游離靶點(diǎn)后將信息導(dǎo)出，通過Cytoscape 3.7.1軟件對交集靶點(diǎn)信息分析，獲得交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,其顏色越紅表示degree值越大，見圖2。

圖2 成分和疾病交集靶點(diǎn)分析Fig.2 Analysis of the components and disease intersection targets

2.3 藥物-活性成分-交集靶點(diǎn)-疾病互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

藥物-活性成分-交集靶點(diǎn)-疾病互作網(wǎng)絡(luò)中共包括169個(gè)節(jié)點(diǎn)，517條邊，粉色菱形為藥物，紫色六邊形為CGN，綠色三角為活性成分，淺藍(lán)色長方形為活性成分和CGN的交集靶點(diǎn)，見圖3。

注：粉色菱形為藥物，紫色六邊型為疾病，綠色為活性成分，degree值越大綠色三角越大，淺藍(lán)色為活性成分和疾病的交集靶點(diǎn)。圖3 藥物-活性成分-交集靶點(diǎn)-疾病互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Drug-active ingredient-intersection target-disease interaction network

2.4 GO分析和KEGG通路富集分析結(jié)果

2.4.1 GO功能富集分析

對黃芪-白茅根治療CGN涉及的143個(gè)靶蛋白進(jìn)行了分析，共獲得7 084個(gè)GO相關(guān)過程，以P<0.05為篩選條件，篩選出差異的生物過程(biological process，BP)有3 982個(gè)相關(guān)過程，細(xì)胞成分(cellular component，CC)有233個(gè)相關(guān)過程，分子功能(molecular function，MF)有448個(gè)相關(guān)過程。按照P值從小到大的順序選取前20做圈圖，圖4(a)列出了GO-BP富集結(jié)果，發(fā)現(xiàn)黃芪-白茅根主要涉及到含氧化合物的反應(yīng)、細(xì)胞增殖、激素反應(yīng)等過程。圖4(b)列出了GO-CC富集分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)黃芪-白茅根主要作用于細(xì)胞膜、質(zhì)膜和胞外空間。對于GO-MF富集分析，其結(jié)果在圖4(c)中展現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)黃芪-白茅根的靶標(biāo)涉及信號受體結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)二聚化活性以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。4(d)為各選取BP、CC、MF前10個(gè)相關(guān)過程所做的條形圖。圖4相關(guān)表格見OSID附表2～4。

圖4 GO功能富集分析Fig.4 GO functional enrichment analysis

圖4(續(xù))

2.4.2 KEGG富集通路分析

對黃芪-白茅根治療CGN涉及的交集靶點(diǎn)進(jìn)行分析，獲得230個(gè)KEGG信號通路，以P<0.05為篩選條件，篩選出差異KEGG條目159個(gè)，P值從小到大排序，對前20條信號通路分析，發(fā)現(xiàn)其涉及IL-17信號通路、TNF信號通路、C型凝集素受體信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等，主要通路見表2(全表見OSID附表5)。圖5(b)中網(wǎng)絡(luò)圖紅色為P值較小的前20通路，紅色三角形表示通路黃色為富集在相關(guān)通路上面的相關(guān)靶點(diǎn)，見圖5。

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

表2 藥物與疾病交集靶點(diǎn)的部分KEGG通路富集Table 2 Part of KEGG pathway enrichment of drug and disease intersection targets

2.5 核心PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將活性成分-疾病的交集數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，利用degree、BC、CC中位數(shù)為篩選條件獲得55個(gè)核心靶點(diǎn)，再以degree值從大到小排序，篩選前10個(gè)靶點(diǎn)，IL-6、AKT1、VEGFA、TNF、TP53、PTGS2、JUN、CASP3、MMP9、EGF用于分子對接，見圖6。

圖6 藥物-疾病交集靶點(diǎn)核心PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Core PPI network of drug-disease intersection targets

2.6 核心成分與核心靶點(diǎn)對接

結(jié)果顯示，所有分子與蛋白的結(jié)合能均小于-20.93 kJ/mol，說明配體能與受體自發(fā)結(jié)合，其中槲皮素(MOL000098)、異鼠李素(MOL000354)、山柰酚(MOL000422)、dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol(MOL000380)與核心靶點(diǎn)TNF結(jié)合能最好，見圖7。

圖7 活性化合物和靶點(diǎn)蛋白分子對接結(jié)果及MOL000098與TNF的分子對接圖Fig.7 Docking results of active compounds and target proteins and molecular docking diagram of MOL000098 and TNF

3 討論

本文借助可視化相關(guān)工具，初步探究黃芪-白茅根治療慢性腎炎的作用。通過TCMSP及BATMAN-TCM兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的結(jié)果進(jìn)行整合和刪減，最終得到與黃芪-白茅根相關(guān)的活性成分27個(gè)、271個(gè)靶點(diǎn)。通過挖掘GeneCards、OMIM、DisGeNET、Drugbank、DiGSeE這5個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫，共獲得了2 360個(gè)CGN相關(guān)靶點(diǎn)。通過在線工具繪制了黃芪-白茅根相關(guān)靶點(diǎn)和CGN相關(guān)靶點(diǎn)的維恩圖，得到黃芪-白茅根治療CGN的143個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。CGN作為一種自身免疫介導(dǎo)的腎小球損傷的慢性腎臟疾病，以循環(huán)炎癥細(xì)胞浸潤以及腎小球細(xì)胞增殖為特征[27-28]，其中槲皮素在藥物-活性成分-交集靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)中degree最高，被認(rèn)為是潛在的活性成分，在CGN的治療中起著關(guān)鍵的作用，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎和抑制增殖的作用。Yuan等[29]發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過抑制中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)減輕炎癥進(jìn)展；Liu等[30]發(fā)現(xiàn)槲皮素還可降低TNF-α誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖，抑制PTX3生成，參與NF-κB信號通路；Ishikawa等[31]通過對總細(xì)胞數(shù)、有絲分裂細(xì)胞的百分比和[(3) H]-胸苷的摻入進(jìn)行評估，3種測定都表明槲皮素顯著減弱了大鼠腎小球系膜細(xì)胞的促有絲分裂活性。用過氧化氫或TNF-α 刺激，來研究槲皮素對細(xì)胞凋亡的影響，最終發(fā)現(xiàn)槲皮素具有在體外和體內(nèi)抑制腎小球細(xì)胞有絲分裂和凋亡的潛力。

對藥物和疾病的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，探討其生物學(xué)機(jī)制，提示黃芪-白茅根藥對CGN的治療機(jī)制是多個(gè)靶點(diǎn)的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)黃芪-白茅根藥對主要涉及到含氧化合物的反應(yīng)、細(xì)胞增殖、激素反應(yīng)等過程?；谒幬锖图膊〗患悬c(diǎn)的KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)黃芪-白茅根治療CGN的潛在通路與IL-17信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等信號通路密切相關(guān)，IL-17A和IL-17F可以單獨(dú)誘導(dǎo)促炎基因表達(dá)，特別是與TNF-α、IL-6、G-CSF、IL-1、CXCL、CCL20和基質(zhì)金屬蛋白酶協(xié)同作用。IL-17通過激活NF-κB、MAPK和C/EBP級聯(lián)途徑上調(diào)這些致炎基因[32]。經(jīng)典的PI3K-AKT通路調(diào)節(jié)許多慢性腎臟疾病的發(fā)展過程，包括增殖和炎癥，是慢性腎臟疾病中上調(diào)最頻繁的途徑，包括CGN[33]。慢性腎小球腎炎炎性損傷主要包括炎性因子異常高表達(dá)、炎癥信號通路激活等，其中p38MAPK炎癥信號通路在腎組織炎性病變過程中具有重要意義[34]。

基于中藥活性成分與疾病潛在靶標(biāo)之間的相互作用，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法可從網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲋凶R別潛在的機(jī)制和關(guān)鍵靶標(biāo)?？捎糜诖_定草藥成分的協(xié)同作用，了解中藥配方的組合規(guī)則，并最終幫助臨床醫(yī)生合理地設(shè)計(jì)中藥配伍[35]。分子對接技術(shù)在藥物靶標(biāo)結(jié)合預(yù)測和合成藥物設(shè)計(jì)中起著重要作用，能夠預(yù)測藥物配體和蛋白質(zhì)受體的對接模式和結(jié)合親和力(表明對接模式的穩(wěn)定性)。我們對篩選出的核心成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行了分子對接，以驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果。IL-6、AKT1、VEGFA、TNF、TP53、PTGS2等55個(gè)蛋白靶點(diǎn)是黃芪-白茅根治療CGN過程中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，提示黃芪-白茅根可能通過調(diào)控這些靶點(diǎn)發(fā)揮作用，改善CGN。有研究發(fā)現(xiàn)[36]，腎組織中的細(xì)胞因子失衡表現(xiàn)為促炎性 IL-17、IL-6、TNF-α水平升高以及抗炎性IL-10和T調(diào)節(jié)細(xì)胞水平降低，細(xì)胞因子的失衡反映了CGN的高活性和疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)?；诤诵腜PI網(wǎng)絡(luò)分析，我們選擇了10個(gè)靶點(diǎn)用于后續(xù)分子對接。從活性成分-活性靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中按照degree、BC、CC中位數(shù)為篩選條件獲得了靶向這些蛋白質(zhì)的14個(gè)核心成分，包括槲皮素、異鼠李素、山柰酚等。采用AutoDock Vina和LigPlot進(jìn)行對接并且使用PyMOL軟件可視化，見圖7。在我們選擇的10個(gè)核心靶點(diǎn)中，TNF與槲皮素、異鼠李素、山柰酚以及dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol的結(jié)合親和力最低。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接闡述了黃芪-白茅根的活性成分、靶點(diǎn)及通路之間相互作用的關(guān)系，黃芪-白茅根的活性成分可通過多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮治療CGN的作用，為黃芪-白茅根治療CGN的提供了理論依據(jù)。