趙志國(guó)，張敏敏，李月，王岱杰，楊國(guó)紅，王曉，趙恒強(qiáng)*

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) a.山東省分析測(cè)試中心;b.藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014)

西洋參別名花旗參、洋參、美國(guó)人參等，是五加科人參屬多年生草本植物，原產(chǎn)于美國(guó)和加拿大，為世界名貴藥材[1]。近年來(lái)，我國(guó)山東、陜西、東北三省等地均已引種成功，為解決西洋參的藥源開(kāi)辟了新的途徑。西洋參多糖是西洋參中一類具有特殊生物活性的物質(zhì)，在西洋參根中含量達(dá)10%左右，具有明確的抗衰老、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)血糖、調(diào)控造血、抗微生物、提高免疫力等作用[2-6]。不同的生物學(xué)活性與多糖的結(jié)構(gòu)存在密切聯(lián)系，而各單糖的種類與比例對(duì)進(jìn)一步探究多糖的物理化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和構(gòu)效關(guān)系至關(guān)重要[7]。多糖的單糖組成是反映多糖結(jié)構(gòu)和活性的重要參數(shù)，對(duì)于多糖的結(jié)構(gòu)表征及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。Cheong等[8]采用化學(xué)衍生氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)法測(cè)定了西洋參、人參和三七多糖的單糖組成，發(fā)現(xiàn)其均由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，西洋參和人參中阿拉伯糖、半乳糖醛酸、葡萄糖和半乳糖含量高于鼠李糖和甘露糖，而三七中含有較多的葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。另外，西洋參的主要藥用部位是主根，而蘆頭和參須則往往棄之不用。對(duì)西洋參不同藥用部位化學(xué)成分進(jìn)行對(duì)比分析，對(duì)進(jìn)一步提高西洋參資源利用率具有重要意義。目前為止，有關(guān)西洋參不同部位人參皂苷的對(duì)比研究報(bào)道較多[9-11]，而有關(guān)其單糖組成的對(duì)比研究未見(jiàn)報(bào)道。

液相色譜法是單糖組成分析較常用的方法[12]，但由于單糖的極性較強(qiáng)，在普通反相色譜柱上難以保留且沒(méi)有紫外吸收，電離響應(yīng)弱，一般需要經(jīng)過(guò)衍生化之后再接入紫外檢測(cè)器或質(zhì)譜進(jìn)行分析[13-15]。而親水色譜法(hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC)則是以強(qiáng)極性材料為固定相，對(duì)水溶性和極性成分具有較好的吸附和分離效果，對(duì)糖類成分的分離分析表現(xiàn)良好[16-17]。電噴霧式檢測(cè)器(charged aerosol detector，CAD)具有靈敏度高、適合梯度洗脫、特別適合沒(méi)有紫外吸收成分的檢測(cè)等特點(diǎn)[18-20]。本課題組在前期開(kāi)展了基于HILIC-CAD技術(shù)的單糖組成分析[21]，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。

本研究建立了親水色譜-電霧式檢測(cè)器-電噴霧-飛行時(shí)間質(zhì)譜(HILIC-CAD-ESI-TOF/MS)測(cè)定西洋參多糖的單糖組成的方法，并用于西洋參不同部位單糖組成的對(duì)比分析，以期為西洋參的單糖組成分析及不同藥用部位的開(kāi)發(fā)利用提供方法和數(shù)據(jù)參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

色譜柱為Waters Xbridge Amide柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(美國(guó)沃特世公司)；Bruker Impact II ESI-TOF-MS質(zhì)譜儀(德國(guó)布魯克公司)；賽默飛世爾Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國(guó)賽默飛世爾公司)；SBL-10DT型恒溫超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；十萬(wàn)分之一電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)。

1.2 材料

對(duì)照品：葡萄糖(批號(hào)S10S9I69833)、阿拉伯糖(批號(hào)AJ0702FA14)、鼠李糖(批號(hào)SJ0715GA13)、果糖(批號(hào)S05A6G3)、木糖(批號(hào)B02M6W1)、巖藻糖(批號(hào)TM0312QB14)、甘露糖(批號(hào)AJ0603LA14)、葡萄糖醛酸(批號(hào)K14J7S9017)、半乳糖醛酸(批號(hào)AJ0603LA14)，均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司(純度大于98%)。乙腈、乙酸銨(瑞典歐森巴克化學(xué)公司，色譜純)，95%乙醇(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司，分析純)，三氟乙酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純)，其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水，西洋參樣品均來(lái)自山東文登西洋參種植基地，其中，ZG1-10為主根，LT 1-5為蘆頭，SX1-5為參須。

1.3 多糖的提取

將西洋參置于真空干燥箱中(60 ℃)烘干，將不同部位分開(kāi)，粉碎，過(guò)篩。準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品粉末置于帶塞三角瓶中，加入30 mL純凈水，于超聲提取器中(功率300 W，溫度90 ℃)提取40 min，放冷15 min，離心10 min(6 000 r/min)，抽濾，濾液定容至30 mL。采用Sevage法除蛋白，反復(fù)萃取直至無(wú)蛋白析出。濾液加適量的95%乙醇，使乙醇的最終濃度為80%，放于冰箱中(12 h)，用于沉淀粗多糖，離心15 min(6 000 r/min)，上清液倒掉，沉淀物依次經(jīng)95%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌，之后水浴蒸干，熱水復(fù)溶，再次離心15 min(6 000 r/min)，取上清液，備用。

1.4 多糖的完全水解

參考文獻(xiàn)[21]的方法并作適當(dāng)修改，吸取700 μL的多糖溶液于水解管中，加入5.0 mol/L的三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)溶液700 μL，加蓋密封后超聲(溫度90 ℃，功率300 W)酸解2 h。酸解產(chǎn)物用氮?dú)獯蹈刹⒂眉状级啻蜗礈欤猿FA殘留。

1.5 對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱取木糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸對(duì)照品適量，各置于1 mL容量瓶中，作為對(duì)照品溶液。

1.6 供試品溶液的配制

1.7 色譜條件

Waters Xbridge Amide柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美國(guó)沃特世公司)，流動(dòng)相A為乙酸銨水溶液，B為乙腈溶液。洗脫梯度0～31 min，90%～75%B。流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫40 °C。CAD檢測(cè)參數(shù)：氣體源為N2，壓力8.8 kPa，F(xiàn)ilter 2.0 sec，霧化器溫度60 °C?；旌蠈?duì)照品及樣品的UPLC-CAD色譜圖見(jiàn)圖1。

注：1—鼠李糖； 2—巖藻糖； 3—木糖； 4—阿拉伯糖；5—果糖；6—甘露糖；7—葡萄糖；8—葡萄糖醛酸；9—半乳糖醛酸。圖1 混合對(duì)照品和樣品的UPLC-CAD色譜圖Fig.1 UPLC-CAD of the standards and sample

1.8 質(zhì)譜條件

高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜電噴霧正、負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500；干燥氣流速8.0 L/min；干燥氣溫度200 °C；毛細(xì)管電壓2.5 kV；噴霧氣壓0.2 MPa；碰撞能量8.0 eV；傳輸時(shí)間300 μs。根據(jù)各化合物在負(fù)離子模式下產(chǎn)生的母離子、子離子的精確分子量信息，結(jié)合對(duì)照品和參考文獻(xiàn)，分別對(duì)其進(jìn)行定性鑒別，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 化合物的ESI-TOF/MS精確質(zhì)量測(cè)量結(jié)果Table 1 Accurate mass measurements of compounds obtained using ESI-TOF/MS

1.9 數(shù)據(jù)處理

MS/MS方法數(shù)據(jù)的分析在Bruker Impact II ESI-TOF-MS質(zhì)譜儀軟件上進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別采用Excel 2010、SPSS 17.0軟件和Origin 7.5軟件進(jìn)行處理和繪圖分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

分別吸取配好的9種對(duì)照品溶液適量至容量瓶中，充分混勻后稀釋至不同濃度，按1.7項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以各對(duì)照品質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，9種成分標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0，說(shuō)明其線性關(guān)系良好。檢出限在0.03～0.13 μg/mL之間，定量限在0.10～0.42 μg/mL之間，說(shuō)明方法靈敏度較高。

表2 線性關(guān)系考察Table 2 The results of calibration

2.1.2 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按1.7項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得9種成分的保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.24%、0.27%、0.19%、0.24%、0.12%、0.14%、0.08%、0.07%、0.28%，均小于1%；峰面積RSD分別為4.08%、3.00%、2.65%、2.73%、2.63%、2.71%、2.21%、2.53%、2.96%，均小于5%。表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次多糖樣品，按1.6項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液，按1.7項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得9種成分峰的保留時(shí)間RSD分別為0.06%、0.32%、0.16%、0.20%、0.10%、0.06%、0.08%、0.06%、0.28%，均小于1%；峰面積RSD分別為4.30%、3.47%、4.00%、3.85%、3.35%、1.76%、1.43%、1.80%、3.76%，均小于5%。表明方法重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液分別于0、3、6、12、18、24 h按1.7項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得9種成分的保留時(shí)間RSD分別為0.20%、0.51%、0.27%、0.19%、0.15%、0.20%、0.15%、0.15%、0.09%，均小于1%；峰面積RSD分別為2.46%、3.38%、2.62%、2.17%、1.58%、2.35%、1.15%、3.23%、2.14%，均小于5%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批次多糖樣品3份，分別精密加入不同量的鼠李糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、果糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸對(duì)照品適量，按1.4項(xiàng)下方法進(jìn)行水解，并按1.6項(xiàng)下方法制成供試品溶液后，按1.7項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析檢測(cè)，計(jì)算加樣回收率(表3)，9種成分的加樣回收率在94.17%～107.15%之間，具有較好的方法準(zhǔn)確性。

表3 加樣回收率試驗(yàn)(n=3)Table 3 Sample recovery test (n=3)

表3(續(xù))

2.2 不同部位單糖組成

采用本試驗(yàn)方法對(duì)提取的西洋參多糖樣品經(jīng)1.4項(xiàng)下方法水解后，按1.6項(xiàng)下方法制成供試品溶液，根據(jù)1.7項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定20批次樣品中9種成分的含量。西洋參各部位(主根、蘆頭、參須)多糖水解產(chǎn)物均由鼠李糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等共同組成(圖2)，其中葡萄糖的含量最高，各部位平均含量依次為(2.123±0.070)mg/g、(1.237±0.245)mg/g、(0.805±0.095)mg/g。其次是半乳糖醛酸，各部位平均含量依次為(0.322±0.045)mg/g、(0.376±0.096)mg/g、(0.280±0.030)mg/g。木糖含量最低，各部位平均含量依次為(0.008±0.001)mg/g、(0.008±0.001)mg/g、(0.008±0.002)mg/g。

西洋參不同部位中各單糖含量分布存在一定特征性。主根中葡萄糖含量較高，其平均值為(2.123±0.070)mg/g；蘆頭中鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸含量較高，其平均值分別為(0.037±0.006)mg/g、(0.179±0.023)mg/g、(0.158±0.028)mg/g、(0.036±0.006)mg/g、(0.069±0.007)mg/g、(0.376±0.096)mg/g；參須中巖藻糖含量較高，其平均值為(0.120±0.005)mg/g。不同部位中9種單糖含量見(jiàn)圖2所示。

圖2 西洋參不同部位單糖組成Fig.2 Composition of monosaccharides in the different parts of Panacis Quinquefolii Radix

2.3 主成分分析

采用SPSS等數(shù)據(jù)分析軟件，以西洋參中9個(gè)化合物的含量測(cè)定結(jié)果作為變量，對(duì)西洋參不同部位進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)，以綜合評(píng)析這3個(gè)不同部位的差異性。

通過(guò)SPSS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)西洋參3個(gè)不同部位中的9個(gè)成分進(jìn)行PCA處理，以此為依據(jù)對(duì)西洋參不同部位進(jìn)行綜合評(píng)析。根據(jù)西洋參主成分矩陣結(jié)果，建立西洋參質(zhì)量評(píng)價(jià)模型，計(jì)算每個(gè)樣本的綜合評(píng)價(jià)得分，通過(guò)綜合評(píng)價(jià)得分對(duì)比可以看出西洋參的主根、蘆頭、參須不同部位之間可以明顯地區(qū)分。說(shuō)明西洋參不同部位的單糖組成存在一定的差異，有望作為化學(xué)標(biāo)記物用于其區(qū)分判別,詳見(jiàn)圖3。

圖3 西洋參不同部位的PCA三維圖譜Fig.3 Three-dimensional map of PCA analysis for the different parts of Panax quinquefolii Radix

3 結(jié)論

本研究建立了親水色譜-電霧式檢測(cè)器-電噴霧-飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析測(cè)定西洋參多糖單糖組成的方法，結(jié)果表明，該方法樣品處理速度快、靈敏度較高。對(duì)西洋參各部位單糖組成的分析檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其不同部位多糖均由鼠李糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等組成，但不同部位含量卻存在一定的差異，主根中葡萄糖含量較高，蘆頭中鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸含量較高，參須中巖藻糖含量較高。采用單糖含量結(jié)合PCA分析可以實(shí)現(xiàn)對(duì)西洋參不同部位的正確區(qū)分。本研究為西洋參多糖的單糖組成分析提供了方法和技術(shù)支持，并可為不同藥用部位的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。