曹愷欣， 武俊瑞,3， 李 默， 韓 琦， 于 博， 祁姝旖，王子健， 烏日娜,3,*

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.遼寧省食品發(fā)酵技術(shù)工程研究中心， 遼寧 沈陽(yáng) 110866；3.沈陽(yáng)市微生物發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 沈陽(yáng) 110866)

益生菌是一類(lèi)對(duì)宿主有益的活性微生物，當(dāng)其黏附于宿主腸道內(nèi)時(shí)，才能發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)失調(diào)、促進(jìn)機(jī)體免疫功能提升等作用[1-2]。由于外源性益生菌的腸黏膜黏附性差、競(jìng)爭(zhēng)力弱和定植困難等原因[3-4]，外源性益生菌的補(bǔ)充在影響人類(lèi)腸道菌群構(gòu)成、促進(jìn)健康方面的作用是有限的。因此，提高益生菌的腸道黏附能力成為益生菌在宿主腸道中穩(wěn)定定植的關(guān)鍵[5]。

巰基化合物具有良好的生物黏附性，能與益生菌表面蛋白上的半胱氨酸殘基形成二硫鍵[6]，也可通過(guò)巰基或二硫鍵的交換反應(yīng)，與黏液凝膠層中富含半胱氨酸的區(qū)域形成二硫鍵，通過(guò)共價(jià)鍵緊密結(jié)合于黏膜[6-8]，進(jìn)而連接益生菌和腸黏液，促進(jìn)益生菌的腸道定植。Leitner等[8]通過(guò)證實(shí)巰基化聚合物能與黏蛋白間形成二硫鍵，為巰基化聚合物黏膜黏附機(jī)理提供了依據(jù)。徐詠梅等[9]研究發(fā)現(xiàn)，巰基化羧甲基殼聚糖能保留羧甲基殼聚糖的生物特性，同時(shí)也具備優(yōu)良的生物黏附性。

多糖具有保護(hù)腸道屏障，免疫調(diào)節(jié)等益生作用[10]。黨參多糖(Codonopsispilosulapolysaccharide)具有改善腸道微生態(tài)的功能，其表面含有大量的羥基，可經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾得到巰基化合物[11]。目前已有關(guān)于香菇柄多糖的乙?；揎梉12]，青錢(qián)柳多糖的羧甲基化修飾的研究[13]，但尚未見(jiàn)將黨參多糖化學(xué)修飾后應(yīng)用于益生菌腸道定植方面的報(bào)道。鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGG，LGG)是人體腸道內(nèi)重要的益生菌[14]，能耐受胃液進(jìn)入腸道，維護(hù)腸道菌群平衡和腸道穩(wěn)態(tài)平衡，且全基因組明確，易于對(duì)其進(jìn)行腸道定植的定量分析[15]。本研究將前期分離純化所得黨參多糖組分(CPP-2)進(jìn)行羧甲基化修飾，得到羧甲基黨參多糖(C-CPP-2)，再對(duì)其進(jìn)行巰基化修飾，得到巰基化黨參多糖(sC-CPP-2)。利用與LGG的體外腸道黏附實(shí)驗(yàn)以及與海藻酸鈉形成的復(fù)合膜，分析黨參多糖及其修飾組分對(duì)LGG黏附性的影響，并驗(yàn)證sC-CPP-2與腸道黏液之間的相互作用關(guān)系，以期為促進(jìn)益生菌的腸道黏附定植研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氫氧化鈉、一氯乙酸、冰醋酸、甲醇、鹽酸、溴化鉀、酚酞、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、MRS瓊脂培養(yǎng)基，均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)，購(gòu)自北京化學(xué)試劑廠(chǎng)。以上試劑為分析純。live/dead?BacLight TM細(xì)菌活性試劑盒Syto 9，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

LGG，由內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司饋贈(zèng)；Sprague-Dawley大鼠(8～10周齡BALB/c雄性小鼠)，北京華阜康生物科技有限公司提供，每籠飼養(yǎng)3只，光/暗循環(huán)12 h，自由取食飲水，馴化1周，實(shí)驗(yàn)前需禁食(不禁水)至少48 h。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理編號(hào)：License No. SYXK2021-0001。

1.2 主要儀器與設(shè)備

MLS- 3780型高壓蒸汽滅菌鍋，日本三洋公司；Nicolet- 170型傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)，美國(guó)Nicolet公司；SHA- B型恒溫水浴鍋，金壇市精達(dá)儀器制造廠(chǎng)；ZEN1500型自動(dòng)電位滴定儀，英國(guó)Malvern公司；FD53型高溫干燥箱，德國(guó)Binder公司；AR- 1500型流變儀，北京歐亞星宇科技有限公司；Secura225D- 1CN 型天平，德國(guó)Sartorius公司。S8100型掃描電子顯微鏡，日本日立高科技公司；LSM 710型激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)Lavision Biotec公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1C-CPP-2的制備及結(jié)構(gòu)表征

1.3.1.1 C-CPP-2的制備

取1 g CPP-2充分溶于50 mL去離子水中，加入150 mL NaOH溶液(3 mol/L)，攪拌10 min后加入20 g一氯乙酸，65 ℃下反應(yīng)4 h，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH值至7.0，進(jìn)行透析，直至剩余試劑被消除。將透析得到的產(chǎn)物真空冷凍干燥，即得C-CPP-2。

1.3.1.2 羧甲基取代度的測(cè)定

參照Li等[16]和房斐等[17]的方法，利用中和滴定法測(cè)定C-CPP-2羧甲基取代度(DS)。取10 mg C-CPP-2于100 ℃干燥1 h，冷卻至室溫，加入3 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇水溶液，充分?jǐn)嚢? min，用50 mL NaOH溶液(0.5 mol/L)稀釋?zhuān)瑪嚢?～5 h。計(jì)算方法見(jiàn)式(1)和式(2)。

DS=0.162X/(1-0.058X)；

(1)

X=C1V1-C2(V2-V0)。

(2)

式(1)中，DS為羧甲基取代度；

式(2)中，C1為NaOH濃度，0.5 mol/L；V1為氫氧化鈉溶液體積，50 mL；C2為鹽酸濃度，0.1 mol/L；V2為消耗的鹽酸溶液體積，mL；V0為空白溶液消耗的鹽酸溶液體積，mL。

1.3.1.3 紅外光譜分析

取20 mg CPP-2樣品，與200 mg溴化鉀研磨后壓成球團(tuán)，用紅外光譜儀在400～4 000 cm-1內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，確定羧基的取代情況。

1.3.2sC-CPP-2共軛物的制備及結(jié)構(gòu)表征

1.3.2.1 sC-CPP-2共軛物的制備

取100 mg C-CPP-2充分溶解于20 mL蒸餾水中，加入166 mg EDC，室溫?cái)嚢? h，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入76 mg NAC，攪拌24 h，蒸餾水透析24 h，真空冷凍干燥，得到sC-CPP-2。

1.3.2.2 巰基含量的測(cè)定

參照段好剛[6]的方法，取50 mg sC-CPP-2，溶于100 mL去離子水中，取1 mL樣品溶液采用Ellman’s法測(cè)定其吸光度，根據(jù)式(3)計(jì)算sC-CPP-2中巰基含量。

Y=(X+0.012 7)/3.495。

(3)

式(3)中：Y為巰基含量，μmol/g；X為421 nm處測(cè)定的吸光度值。

1.3.2.3 電位變化分析

根據(jù)Liu[7]的方法，利用電位質(zhì)子滴定法測(cè)定CPP-2、C-CPP-2和sC-CPP-2的ζ-電位。

1.3.3sC-CPP-2對(duì)LGG的黏附效果的測(cè)定

1.3.3.1 腸黏液的制備

參照北婷婷[18]的方法制備大鼠腸黏液，并于超低溫保藏。

1.3.3.2 CPP-2/LGG、C-CPP-2/LGG、sC-CPP-2/LGG懸液的制備

將LGG菌體重懸于PBS中，調(diào)整LGG菌濃度為109CFU/mL。取5 mg CPP-2、C-CPP-2和sC-CPP-2分別加入1 mL菌液中，混合均勻，得CPP-2/LGG、C-CPP-2/LGG、sC-CPP-2/LGG混合懸液，對(duì)照組為生理鹽水/LGG(NS)。

1.3.3.3 sC-CPP-2體外黏液黏附實(shí)驗(yàn)

參照北婷婷[18]的方法，檢測(cè)腸黏液對(duì)LGG的黏附作用。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入1.3.3.1中制備所得腸黏液，并分別加入1.3.3.2中制備所得混合懸液，密封置于4 ℃冰箱過(guò)夜，吸取緩沖液洗滌2次。加入體積分?jǐn)?shù)為1%的SDS與0.1 mol/L NaOH混合的裂解液，釋放黏附的細(xì)菌。進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，根據(jù)式(4)計(jì)算腸黏液對(duì)LGG的黏附率。

黏附率=B/A×100%。

(4)

式(4)中：A為總細(xì)菌數(shù)，CFU/mL；B為黏附的細(xì)菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.3.4 sC-CPP-2的體外腸道黏附實(shí)驗(yàn)

脊椎脫臼法處死大鼠后，鋪4份1.5 cm×1.5 cm×2 mm的大鼠腸道于無(wú)菌載玻片上，分別滴加1.3.3.2中制備所得混合懸液。將載玻片放置于滅菌離心管中輕微振蕩2 h后用生理鹽水沖洗，并將沖洗液收集后梯度稀釋?zhuān)罹?jì)數(shù)，根據(jù)式(5)計(jì)算黏附率。

黏附率=(A-B)/A×100%。

(5)

式(5)中：A為總細(xì)菌數(shù)，CFU/mL；B為未黏附的細(xì)菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.4LGG的黏液黏附性能的測(cè)定

參照Liu等[7]的方法，使用細(xì)菌活性試劑盒對(duì)LGG菌懸液染色，制作腸切片，采用激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行3D層掃，觀(guān)察黏液中LGG吸附情況。

1.3.5黨參多糖/海藻酸鈉復(fù)合薄膜對(duì)LGG黏附作用的測(cè)定

1.3.5.1 CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2海藻酸鈉復(fù)合薄膜的制備

各取0.3 g海藻酸鈉分別溶解于CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2(5 mg/mL，10 mL)水溶液中，空白組(BLK)不加糖，室溫?cái)嚢? h，加入150 mg甘油，超聲處理2 min去除氣泡。各取10 mL溶液分別倒入直徑為9 cm的塑料圓柱模具中，60 ℃烘干6 h。將膜取出，在50%濕度、25 ℃條件下放入烘干機(jī)中干燥48 h后備用。

1.3.5.2 復(fù)合薄膜對(duì)LGG的黏附作用的測(cè)定

將1.3.5.1中制備的各復(fù)合薄膜(1 cm2)與染色的LGG溶液(1 mL，4×108CFU/mL)合并，37 ℃孵育30 min，滅菌PBS沖洗3次后，用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察。為計(jì)算黏附菌數(shù)，將相同數(shù)量的未染色的LGG與CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2膜37 ℃孵育30 min，用滅菌PBS沖洗3次后，將剩下的益生菌溶液全部鍍到MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃孵育2 d。未黏附的益生菌細(xì)菌數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定。LGG黏附于CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2的黏附率根據(jù)1.3.3.4中式(5)計(jì)算。

1.3.6CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2與腸道黏液黏附作用的測(cè)定

1.3.6.1 流變學(xué)特性的測(cè)定

參照Huamani-Melendez 等[19]和Cohen等[20]的方法，各取CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2溶液(5 mg/mL)加入至等體積的腸黏液中制成均勻混合物，于1 Hz頻率下進(jìn)行線(xiàn)性黏彈性區(qū)域內(nèi)的振蕩時(shí)間掃描。通過(guò)流變儀測(cè)定3種混合物在剪切速率為0.01～100.00 s-1條件下的黏度變化情況。

1.3.6.2 張力的測(cè)定

參照Liu等[7]的方法，取CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2溶液(500 mg/mL)分別壓縮于平面測(cè)試圓盤(pán)(d=10 mm)中，注射泵固定于天平上方。將大鼠的結(jié)腸組織固定于燒杯底部，注入PBS，使測(cè)試圓盤(pán)降至結(jié)腸組織表面，孵育20 min。注射泵滑塊以2.83 mm/min的速度勻速上升，直至測(cè)試圓盤(pán)與結(jié)腸組織分離。每秒記錄一次天平數(shù)據(jù)，計(jì)算最大分離力并按照梯形法則計(jì)算總黏附功。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和 Duncan 多重比較分析，P<0.05表示差異顯著；利用OriginPro 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 C-CPP-2和sC-CPP-2的結(jié)構(gòu)表征

圖1 CPP-2和C-CPP-2的FT-IR分析

C-CPP-2的羧基進(jìn)一步與N-乙酰-L-半胱氨酸結(jié)合，進(jìn)而將-SH連接到多糖的結(jié)構(gòu)上，得到sC-CPP-2。-SH既能與細(xì)菌表面的黏液結(jié)合蛋白形成穩(wěn)固的S-S，又能與腸道黏液層的半胱氨酸結(jié)合形成S-S[7-8]，連接細(xì)菌和腸道黏液，增加細(xì)菌的腸道黏附作用。經(jīng)過(guò)巰基修飾之后，由式(3)計(jì)算得sC-CPP-2中巰基含量為 (279.50±5.97) μmol/g。CPP-2，C-CPP-2和sC-CPP-2中ζ-電位變化情況見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，經(jīng)羧基甲基化后，ζ-電位從-8.8 mV(CPP-2)下降到-67.5 mV(C-CPP-2)，sC-CPP-2則上升到-53.6 mV，表明sC-CPP-2成功修飾上巰基，且處于巰基和羧基共存狀態(tài)。

不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著。

2.2 sC-CPP-2對(duì)LGG的體外黏液及腸道黏附性的影響

2.2.1體外黏液黏附性分析

為研究sC-CPP-2是否能夠增強(qiáng)LGG的體外黏液黏附作用，由式(4)計(jì)算分別添加生理鹽水、CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2后LGG的黏附性，各組樣品對(duì)LGG的黏附情況見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，與NS組、CPP-2組和C-CPP-2組相比，sC-CPP-2對(duì)LGG的黏附作用顯著增強(qiáng)。表明sC-CPP-2表面巰基與LGG表面蛋白質(zhì)上的半胱氨酸殘基形成二硫鍵，在LGG和黏液之間形成黏附作用，增加了黏液對(duì)LGG的黏附性；且sC-CPP-2與黏液之間的相互作用強(qiáng)度強(qiáng)于CPP-2與黏液之間的相互作用強(qiáng)度。C-CPP-2對(duì)益生菌的吸附率高于CPP-2，可能是由于C-CPP-2的羧基、羥基與腸黏液糖蛋白上唾液酸殘基之間形成的氫鍵和離子鍵所致[25]。

不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著。

2.2.2體外腸道黏附性分析

益生菌通過(guò)胃后，與腸道黏液的長(zhǎng)期黏附是益生菌發(fā)揮其生理功能的先決條件[4]。利用體外腸道黏附實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證sC-CPP-2/LGG對(duì)LGG的黏附作用。各組樣品對(duì)LGG的黏附情況見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，與NS組、CPP-2組和C-CPP-2組相比，sC-CPP-2對(duì)LGG的黏附作用顯著增強(qiáng)，可能是sC-CPP-2表面巰基與LGG和黏液之間形成共價(jià)鍵，增加黏液對(duì)LGG的黏附性。相比于體外黏液的黏附實(shí)驗(yàn)，NS組、CPP-2組和C-CPP-2組對(duì)LGG的體外腸道黏附作用更好，可能是其與LGG腸道黏液間存在氫鍵、范德華力等其他作用力的影響。

不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著。

2.3 sC-CPP-2對(duì)LGG的腸道黏附性分析

LGG在腸道中的黏附情況CLSM觀(guān)察結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)，CPP-2和C-CPP-2組有少量的LGG黏附到腸道，sC-CPP-2組的LGG黏附效果最佳，黏附數(shù)量最多。與CPP-2相比，sC-CPP-2和LGG之間的相互作用更強(qiáng)，這可能是因?yàn)閟C-CPP-2和LGG之間存在二硫鍵。這一結(jié)果與體外黏液和腸道黏附實(shí)驗(yàn)相對(duì)應(yīng)，再次證明sC-CPP-2可以增加LGG的腸道黏附性。Liu等[7]對(duì)魔芋葡甘聚糖的修飾也得到了與本研究相似的結(jié)果。

圖5 不同黨參多糖對(duì)LGG的腸道黏附性激光共聚焦觀(guān)察結(jié)果

2.4 sC-CPP-2/海藻酸鈉復(fù)合薄膜對(duì)LGG的黏附性分析

為進(jìn)一步考察不同組復(fù)合薄膜對(duì)LGG的吸附作用，利用不同黨參多糖與海藻酸鈉形成復(fù)合薄膜，間接驗(yàn)證巰基化黨參多糖對(duì)LGG的黏附性。由式(5)計(jì)算不同樣品組對(duì)LGG的黏附率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可見(jiàn)，BLK組、CPP-2組和C-CPP-2組對(duì)LGG均有一定的黏附作用，但巰基化修飾后的黨參多糖sC-CPP-2對(duì)LGG的黏附率最大，表明sC-CPP-2聚合物與LGG之間的相互作用更強(qiáng)，對(duì)LGG有更強(qiáng)的黏附作用，這與2.2和2.3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著。

同時(shí)，本研究還利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)LGG在不同復(fù)合薄膜上的黏附情況進(jìn)行了觀(guān)察，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可見(jiàn)，sC-CPP-2/海藻酸鈉組薄膜上吸附的LGG顯著多于海藻酸鈉組、CPP-2/海藻酸鈉組和C-CPP-2/海藻酸鈉組，說(shuō)明sC-CPP-2/海藻酸鈉薄膜對(duì)LGG有較強(qiáng)的黏附作用。染色的LGG在sC-CPP-2薄膜上的熒光強(qiáng)度高于其他組復(fù)合膜，進(jìn)一步證實(shí)了LGG對(duì)sC-CPP-2/海藻酸鈉薄膜的黏附性最強(qiáng)。此外，CPP-2/海藻酸鈉薄膜在浸水后分解，而sC-CPP-2/海藻酸鈉薄膜在浸水后保持完整，表明二硫鍵增強(qiáng)了膜的機(jī)械強(qiáng)度。sC-CPP-2可能通過(guò)其與黏液和益生菌的雙重黏附作用，在腸黏膜中起到橋梁作用，從而將益生菌保留在腸黏膜中。

圖7 激光共聚焦表征不同黨參多糖/海藻酸鈉復(fù)合膜對(duì)LGG的黏附性

2.5 sC-CPP-2與腸道黏液黏附性分析

2.5.1流變學(xué)測(cè)量結(jié)果

利用流變儀分析CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2與腸道黏液的相互作用關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8(a)和圖8(b)可見(jiàn)，在1 Hz的頻率下，腸道黏液與CPP-2、C-CPP-2混合物的損耗模量G″均大于儲(chǔ)能模量G′，表明混合物呈現(xiàn)黏性占優(yōu)勢(shì)的稀溶液性質(zhì)，具有典型黏性流體特征。圖8(c)顯示，sC-CPP-2與腸道黏液的G′ 和G″在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)了相交，混合物逐漸趨近于彈性占優(yōu)勢(shì)狀態(tài)，說(shuō)明sC-CPP-2與腸道黏液之間通過(guò)二硫鍵形成了具有黏彈性的凝膠網(wǎng)絡(luò)，修飾過(guò)的黨參多糖與腸道黏液的相互作用更強(qiáng)。CPP-2、C-CPP-2及sC-CPP-2與腸道黏液混合物的表觀(guān)黏度如圖8(d)。圖8(d)中，在0.01～100.00 s-1增速剪切過(guò)程中，3種混合物的表觀(guān)黏度均隨剪切速率的升高而降低，sC-CPP-2樣品的表觀(guān)黏度高于C-CPP-2樣品和CPP-2樣品，說(shuō)明sC-CPP-2與腸道黏液的相互作用較強(qiáng)。

圖8 腸道黏液與CPP-2、C-CPP-2、sC-CPP-2混合液的動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性和表觀(guān)黏度分析

2.5.2拉伸實(shí)驗(yàn)測(cè)量結(jié)果

利用經(jīng)典拉伸實(shí)驗(yàn)，記錄各組樣品從腸道表面分離時(shí)的分離力及黏附功的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9(a)可知，sC-CPP-2與黏液之間獲得的分離力[(101.82±5.78) mN]是C-CPP-2與黏液之間獲得的分離力[(71.54±4.60) mN]的近1.5倍，是CPP-2黏液之間獲得的分離力的2倍[(49.53±3.90) mN]。由圖9(b)可知，sC-CPP-2的黏附功[(120.07±6.81) μJ]明顯高于C-CPP-2[(77.60±4.99) μJ]和CPP-2[(51.39±3.90) μJ]，再次證實(shí)了sC-CPP-2與黏液之間的黏合力最強(qiáng)。

不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著。

3 討 論

在腸道微生態(tài)失衡時(shí)，可通過(guò)食用外源性益生菌補(bǔ)充劑來(lái)重塑腸道菌群，改善疾病病癥[26]。一般情況下，由于外源性益生菌腸道黏附性弱，與腸道固有菌群相比競(jìng)爭(zhēng)力差，很多研究者將目光轉(zhuǎn)向高黏附菌株的篩選。蔡紅英[27]利用Caco-2細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)從11株植物乳桿菌中篩選出具有降脂黏附性良好的植物乳桿菌FRT4和FRT10。占萌[28]從12株植物乳桿菌和2株耐久腸球菌中篩選出具有高黏附作用的嗜酸乳桿菌KLDS1.10901。然而，菌株篩選工作量大，且較難篩選出黏附特性好的理想菌株。如何在調(diào)節(jié)腸道菌群，改善腸道健康的同時(shí)，增加益生菌的腸道黏附作用，成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。

黨參多糖具有益生元特性，可與益生菌結(jié)合促進(jìn)宿主微生態(tài)調(diào)節(jié)，從而防治疾病[26]。巰基化修飾多糖可增強(qiáng)多糖的生物黏附性。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CPP-2可促進(jìn)益生菌增殖，但經(jīng)修飾后是否會(huì)影響CPP-2的益生特性還需驗(yàn)證。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C-CPP-2和sC-CPP-2對(duì)益生菌的增殖作用與CPP-2無(wú)顯著差異，說(shuō)明對(duì)CPP-2進(jìn)行羧甲基化和巰基化修飾并不會(huì)改變其對(duì)益生菌的增殖作用；且CPP-2經(jīng)過(guò)羧甲基化修飾之后，紅外光譜結(jié)果證實(shí)，修飾后的C-CPP-2仍保留多糖的結(jié)構(gòu)特征。Li等[16]對(duì)羊肚菌多糖的羧甲基化和Wang等[11]對(duì)青錢(qián)柳多糖的羧甲基化也得到了與本研究相似的結(jié)果；尤其是在羧甲基化的衍生物中發(fā)現(xiàn)了多糖的特征峰，說(shuō)明C-CPP-2雖然被成功羧甲基化，但并未顯著改變其分子結(jié)構(gòu)。因此，對(duì)CPP-2進(jìn)行羧甲基化和巰基化修飾并不會(huì)改變其對(duì)益生菌的增殖作用。未來(lái)將利用微膠囊技術(shù)使益生菌和巰基黨參多糖共包埋，構(gòu)建小鼠急性結(jié)腸炎模型，進(jìn)一步探究益生菌微膠囊對(duì)結(jié)腸炎的緩解作用，為實(shí)現(xiàn)益生菌在結(jié)腸內(nèi)的增殖和黏附定植提供可能。

4 結(jié) 論

為構(gòu)建益生菌與腸道黏液連接的橋梁，本研究對(duì)前期制備所得黨參多糖CPP-2進(jìn)行羧甲基化與巰基化修飾，得到sC-CPP-2；采用體外腸道黏附實(shí)驗(yàn)及與海藻酸鈉形成的復(fù)合膜，檢測(cè)sC-CPP-2對(duì)LGG和腸道黏液的黏附作用，并利用流變學(xué)和經(jīng)典拉伸實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，sC-CPP-2中巰基含量為(279.50±5.97) μmol/g，且處于巰基和羧基共存狀態(tài)。sC-CPP-2/LGG能和黏液之間形成黏附作用，且sC-CPP-2與黏液之間的黏合力最強(qiáng)。sC-CPP-2能增加LGG的腸道黏附性，延長(zhǎng)LGG在腸道內(nèi)的停留時(shí)間，促進(jìn)LGG的腸道黏附定植。希望本研究能夠?yàn)榻鉀Q外源性益生菌腸道黏附性差、定植難等問(wèn)題提供參考。