袁嘉歡，吳 楠，王文辛，蔡芷辰，殷圣鑫，陳海杰，劉訓(xùn)紅,2*，黎 理

1南京中醫(yī)藥大學(xué)；2江蘇省經(jīng)典名方工程研究中心，南京210023；3廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530200

桑寄生Taxilli Herba為桑寄生科植物桑寄生Taxilluschinensis(DC.) Danser的干燥帶葉莖枝；為廣西著名道地藥材[1]，主要分布于廣西的桂南、桂中、桂東地區(qū)；收載于2020版《中國(guó)藥典》，具有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎元之功效，用于治療風(fēng)濕痹痛，腰膝酸軟，筋骨無(wú)力等癥[2]?，F(xiàn)代研究表明，桑寄生主要含有黃酮類(lèi)[3,4]、有機(jī)酸類(lèi)[5]、萜類(lèi)[6]等多種類(lèi)型化學(xué)成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛[7]、降血糖[8]、抗腫瘤[9,10]等多重藥理作用。桑寄生屬于半寄生性植物，寄主多達(dá)36科150多種[11]?！吨袊?guó)藥典》對(duì)桑寄生的寄主植物沒(méi)有明確規(guī)定，目前市場(chǎng)上流通和使用的多為多寄主基源藥材，質(zhì)量參差不齊。不同歷史時(shí)期的本草學(xué)已有不同寄主對(duì)桑寄生藥材質(zhì)量影響的詳實(shí)記載，并已注意到不同寄主桑寄生藥材的毒性、藥效均有不同[12-14]。近年來(lái)，寄主與桑寄生藥材質(zhì)量關(guān)系的研究表明，不同寄主來(lái)源桑寄生中總黃酮、槲皮素和槲皮苷含量存在明顯差異[15-18]，桑寄生會(huì)以一定的形式累積寄主植物的特征性成分[19,20]，同時(shí)不同寄主來(lái)源桑寄生中揮發(fā)性成分的種類(lèi)和含量也存在差異[21]。Xia等[22]發(fā)現(xiàn)桑樹(shù)寄主桑寄生水提物無(wú)肝損傷，漆樹(shù)、油茶、柳樹(shù)、苦楝和夾竹桃5種寄主桑寄生表現(xiàn)出不同程度的肝損傷。Zhang等[23]發(fā)現(xiàn)各寄主來(lái)源桑寄生均具有降壓作用，寄主對(duì)桑寄生的降血壓作用存在影響。

目前對(duì)于不同寄主來(lái)源桑寄生的研究多集中于總黃酮含量的變化[16,17]、HPLC特征指紋圖譜研究[24]及應(yīng)用紅外光譜方法[25]區(qū)分不同寄主桑寄生，對(duì)不同寄主來(lái)源桑寄生中化學(xué)成分的差異性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，對(duì)不同寄主來(lái)源桑寄生差異性化學(xué)成分進(jìn)行研究，對(duì)完善其質(zhì)量控制體系具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)借鑒植物代謝組學(xué)的研究思路與方法[26]，采用超快速液相色譜-三重四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UFLC-Triple TOF-MS/MS)技術(shù)分析不同寄主來(lái)源桑寄生化學(xué)成分的差異性，并通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析找出差異顯著的化學(xué)成分及其變化規(guī)律，旨在為揭示寄主植物對(duì)桑寄生代謝產(chǎn)物合成和積累的影響規(guī)律及探討桑寄生藥材的品質(zhì)形成機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Triple TOFTM5600 System-MS/MS 高分辨四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(配有Peakview 1.2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國(guó)AB Sciex 公司)；SIL-20A XR 超快速液相色譜儀(日本 Shimadzu公司)；Q-500B高速多功能粉碎機(jī)(上海冰都電器有限公司)；ME36S型電子分析天平(1/100萬(wàn)，德國(guó)賽多利斯公司)；BSA224S型電子分析天平(1/1萬(wàn)，德國(guó)賽多利斯公司)； PT-124/85S型電子分析天平(1/10萬(wàn)，華志電子科技有限公司)；Milli-Q超純水制備儀(美國(guó)Millipore公司)；KQ-500B超聲波清洗機(jī)(超聲功率500W，40kHz，昆山超聲儀器有限公司)；H1650-W高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)。

對(duì)照品：槲皮素 3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(批號(hào)DST200703-055)、異櫻花素(批號(hào)DST201227-161)購(gòu)于南京良緯生物科技有限公司；金絲桃苷(批號(hào)P12S11F124379)、(+)-兒茶素(批號(hào)P21J11F11 8380)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；山奈苷(批號(hào)AF21020202)購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司；槲皮苷(批號(hào)111538-200302)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，化合物純度均大于98%。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，購(gòu)于Merck公司。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

桑寄生采集于廣西境內(nèi)，來(lái)源于10個(gè)寄主，每個(gè)寄主上的桑寄生樣品采集4份，樣品信息見(jiàn)表1。藥材干燥方式為實(shí)驗(yàn)室烘箱干燥，采收后均立即干燥。藥材經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉訓(xùn)紅教授鑒定為桑寄生科植物桑寄生Taxilluschinensis(DC.) Danser的帶葉莖枝。留樣憑證保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室。

表1 桑寄生藥材樣品信息

續(xù)表1(Continued Tab.1)

1.2 測(cè)試條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇：乙腈(1∶1，A)-水(含0.4%甲酸，B)；梯度洗脫：0～5 min，2%→6% A；5～6 min，6%→10% A；6～8 min，10%→15% A；8～12 min，15%→18% A；12～18 min，18%→21% A；18～21 min，21%→23%A；21～26 min，23%→25% A；26～30 min，25%→27% A；30～33 min，27%→40% A；33～38 min，40%→50% A；38～40 min，50%→2% A；40～45 min，2%→2% A；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)負(fù)離子模式；離子源溫度(TEM)600 ℃；噴霧電壓(IS)-4 500 V；脫簇電壓(DP)-100 V；質(zhì)量掃描范圍50～1 500m/z；氣簾氣壓力(CUR)40 L/min；霧化氣壓力(GS1)60 L/min；輔助氣壓力(GS2)60 L/min。

1.3 溶液的制備

1.3.1 供試品溶液的制備

取桑寄生藥材樣品，粉碎，過(guò)50目篩。精密稱定0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入15 mL 50%甲醇，密閉，稱定質(zhì)量，室溫下超聲提取30 min，放置冷卻，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足失重，過(guò)濾，濾液以13 000 r/min離心10 min，取上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取槲皮素3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、異櫻花素、金絲桃苷、(+)-兒茶素、山奈苷、槲皮苷對(duì)照品適量，置于10 mL容量瓶中，加適量70%甲醇，超聲使溶解。再分別精密吸取各對(duì)照品溶液適量，加70%甲醇定容至5 mL，配制混合對(duì)照品溶液。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

將質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入MarkerView 1.2.1軟件進(jìn)行峰匹配、峰對(duì)齊和濾噪處理，結(jié)果進(jìn)一步導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件進(jìn)行分析。首先采用PCA初步觀察各樣品的聚集情況，直觀地表達(dá)不同寄主桑寄生的化學(xué)組成差異；在主成分分析基礎(chǔ)上，再用PLS-DA對(duì)各樣品分類(lèi)，其中R2X、R2Y越接近1表示模型越穩(wěn)定，Q2>0.5表示預(yù)測(cè)率高。根據(jù)PLS-DA模型得到的變量權(quán)重值(VIP>1)找到潛在的差異化學(xué)成分。采用t檢驗(yàn)驗(yàn)證多維統(tǒng)計(jì)中找到的差異化學(xué)成分是否在單維統(tǒng)計(jì)中具有顯著性差異，其中P<0.05則表示有顯著性差異。

1.5 差異化學(xué)成分的鑒定

通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜確定精確相對(duì)分子質(zhì)量，二級(jí)質(zhì)譜獲得裂解信息，結(jié)合CNKI(https://www.cnki.net/)，SciFinder (https://scifinder.cas.org/)和HMDB(http://www.hmdb.ca/)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索、對(duì)照品比對(duì)及已報(bào)道文獻(xiàn)，對(duì)VIP>1且P<0.05的差異化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。共有差異化學(xué)成分的量以各樣品對(duì)應(yīng)的峰面積表示，通過(guò)對(duì)不同寄主桑寄生樣品間同一物質(zhì)峰面積的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行計(jì)算，得到差異成分在不同寄主樣品間的相對(duì)含量變化。

2 結(jié)果

2.1 條件的優(yōu)化

2.1.1 樣品處理方法的優(yōu)化

供試品溶液的制備中考察了甲醇、80%甲醇、70%甲醇、60%甲醇、50%甲醇、40%甲醇、30%甲醇7種溶劑，結(jié)果表明50%甲醇為溶劑時(shí)的色譜峰峰型優(yōu)于其他6種溶劑。同時(shí)考察了固液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)和超聲時(shí)間(15、30、45、60、75、90 min)，最終結(jié)果表明當(dāng)固液比為1∶30，溶劑為50%甲醇，超聲時(shí)間為30 min時(shí)得到的相對(duì)峰面積較大。

圖1 不同寄主來(lái)源桑寄生樣品的UFLC-Triple TOF-MS/MS基峰圖Fig.1 UFLC-Triple TOF-MS/MS base peak chromatogram of Taxilli Herba from different host plants注：圖中編號(hào)S1～S10與表1中一致。Note:S1～S10 in Fig.1 were the same as those in Table 1.

2.1.2 色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化

流動(dòng)相的選擇分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.4%甲酸水、乙腈-0.4%甲酸水，甲醇∶乙腈(1∶1)-0.4%甲酸水及梯度洗脫條件下對(duì)樣品中各峰分離度的影響。結(jié)果表明，以甲醇：乙腈(1∶1)-0.4%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，各色譜峰具有較好的峰形和分離效果。前期研究發(fā)現(xiàn)，桑寄生中主要含有黃酮類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)化學(xué)成分，在負(fù)離子模式下有較好的響應(yīng)，因此選擇負(fù)離子模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

根據(jù)優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件，對(duì)不同寄主來(lái)源的桑寄生樣品進(jìn)行UFLC-Triple TOF-MS/MS分析。結(jié)果顯示，10個(gè)不同寄主來(lái)源桑寄生樣品在負(fù)離子模式下的基峰圖基本相似，但某些色譜峰的離子強(qiáng)度存在顯著的差異，說(shuō)明不同寄主來(lái)源的桑寄生樣品在化學(xué)成分是大致相似的，但在含量上有明顯的區(qū)別(見(jiàn)圖1)。

2.2 PCA分析

采用PCA多變量模式識(shí)別方法對(duì)10個(gè)寄主來(lái)源的桑寄生樣品進(jìn)行降維分析。結(jié)果顯示，模型驗(yàn)證結(jié)果(R2X= 0.947，Q2= 0.892)表明該模型穩(wěn)定，預(yù)測(cè)能力較強(qiáng)。10個(gè)寄主桑寄生PCA分析的散點(diǎn)圖(t[1] = 0.636；t[2] = 0.191)示于圖2，可以看出，10個(gè)寄主來(lái)源的桑寄生樣品各自聚為一類(lèi)，分類(lèi)結(jié)果較為理想，說(shuō)明10個(gè)寄主的樣品在化學(xué)成分的種類(lèi)和相對(duì)含量上存在一定的差異。10個(gè)寄主桑寄生相比較，桑樹(shù)寄主與其他寄主桑寄生分布距離較遠(yuǎn)，表明在化學(xué)成分上差異較大，單獨(dú)分布在PC1軸負(fù)半軸和PC2軸正半軸；大葉冬青、山里紅、雞蛋果和無(wú)患子寄主樣品分布在PC1軸正半軸和PC2軸正半軸，四者之間在化學(xué)成分上差異較小，同理，柿子樹(shù)和黃皮樹(shù)寄主的樣品，沙梨、假黃皮和松樹(shù)寄主的樣品也分別在化學(xué)成分種類(lèi)和含量上較為相似。

圖2 不同寄主桑寄生在負(fù)離子模式下PCA得分圖Fig.2 The principal component analysis (PCA) scores scatter plot of Taxilli Herba from different host plants in negative mode

2.3 PLS-DA分析

PLS-DA作為一種有監(jiān)督的模式識(shí)別方法，在本文中用于確定10個(gè)寄主來(lái)源桑寄生樣品之間的差異化學(xué)成分。本文將目前臨床最為常用的桑樹(shù)寄主來(lái)源桑寄生樣品與其他9個(gè)寄主來(lái)源的桑寄生樣品分別進(jìn)行PLS-DA分析，結(jié)果示于圖3，桑樹(shù)寄主和其他9個(gè)寄主來(lái)源的桑寄生樣品沿著PC1軸明顯分開(kāi)。模型驗(yàn)證結(jié)果(R2Y和Q2)顯示模型有效可靠，對(duì)兩組分類(lèi)貢獻(xiàn)較大的差異性成分(VIP>1)數(shù)據(jù)列于表2。

2.4 差異化學(xué)成分的鑒定與相對(duì)定量

通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜確定精確相對(duì)分子質(zhì)量，二級(jí)質(zhì)譜獲得裂解信息，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)搜索、對(duì)照品比對(duì)及已報(bào)道文獻(xiàn)，對(duì)VIP>1且P<0.05的差異化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，初步鑒定出19個(gè)化學(xué)成分，結(jié)果見(jiàn)表3。其中4種成分為共有差異成分，分別為(+)-兒茶素、金絲桃苷、槲皮素 3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、槲皮苷。以共有差異化學(xué)成分在各樣品中對(duì)應(yīng)的峰面積作為相對(duì)含量，得到差異成分在不同寄主樣品間的相對(duì)含量變化。如圖4所示，桑樹(shù)寄主來(lái)源桑寄生樣品中這4種成分的相對(duì)含量均高于其他9個(gè)寄主，黃皮樹(shù)寄主來(lái)源的桑寄生排名第二，無(wú)患子寄主來(lái)源的桑寄生中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和金絲桃苷的相對(duì)含量最低。

圖3 桑樹(shù)寄主與其他寄主桑寄生樣品的PLS-DA得分圖(a)和VIP>1得分圖(b)Fig.3 PLS-DA scores plot (a) and VIP>1 plot (b) of samples from Morus alba L.and other host plants

表2 不同寄主來(lái)源桑寄生樣品PLS-DA分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

桑寄生在我國(guó)具有十分豐富的資源，歷代以桑樹(shù)為寄主的桑寄生得到廣泛認(rèn)同和使用。由于其半寄生性和廣寄性的顯著特征，桑寄生藥材的寄主植物來(lái)源復(fù)雜多樣，而關(guān)于不同寄主來(lái)源桑寄生藥材的質(zhì)量研究多局限于總黃酮含量的測(cè)定，未見(jiàn)對(duì)不同寄主來(lái)源桑寄生化學(xué)成分的差異性報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)基于UFLC-Triple TOF-MS/MS結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)分析不同寄主來(lái)源桑寄生化學(xué)成分的差異性，結(jié)果表明10個(gè)寄主來(lái)源桑寄生樣品在PCA模型中的分類(lèi)效果較為理想，進(jìn)一步通過(guò)PLS-DA分析得到19個(gè)差異化學(xué)成分，其中(+)-兒茶素、金絲桃苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和槲皮苷為共有差異化學(xué)成分。桑樹(shù)寄主桑寄生中這4種成分的相對(duì)含量均高于其他9個(gè)寄主，其次為黃皮樹(shù)和柿子樹(shù)來(lái)源的桑寄生，槲皮素3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和金絲桃苷在無(wú)患子寄主的桑寄生樣品中最低，為區(qū)分不同寄主來(lái)源桑寄生提供重要的辨認(rèn)信息。4種共有差異化學(xué)成分均為黃酮類(lèi)化合物，但在不同寄主來(lái)源桑寄生中含量差異明顯，提示寄主是影響桑寄生藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素，至于含量差異引起的臨床療效變化仍待探索。

表3 不同寄主來(lái)源桑寄生中差異化學(xué)成分的鑒定

圖4 不同寄主來(lái)源桑寄生中共有差異化學(xué)成分的相對(duì)含量變化Fig.4 Relative contents of common differential chemical constituents in Taxilli Herba from different host plants注：a.(+)-兒茶素；b.金絲桃苷；c.槲皮素 3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；d.槲皮苷。Note:a.(+)-Catechin;b.Hyperoside;c.Quercetin 3-O-β-D-glucuronide;d.Quercitrin.

綜上，本研究借鑒植物代謝組學(xué)的研究思路，對(duì)10個(gè)不同寄主來(lái)源桑寄生中化學(xué)成分的差異性進(jìn)行分析，研究結(jié)果可為揭示寄主植物對(duì)桑寄生代謝產(chǎn)物合成和積累的影響以及探討桑寄生藥材品質(zhì)形成機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。