王姣姣，袁平川，許寒池，陳 穎，張斯佳，田夢(mèng)云，余子琪，柳春燕*

1皖南醫(yī)學(xué)院安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心 皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥物研發(fā)中心；2活性生物大分子安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3安徽省皖南地區(qū)植物藥活性篩選與再評(píng)價(jià)工程實(shí)驗(yàn)室，蕪湖 241000

胃癌是全球第五大常見癌癥和第三大癌癥死亡原因[1]，在進(jìn)展期多采用化療，常見化療藥物如順鉑和5-氟尿嘧啶等，然而化療藥物的耐藥性和毒性導(dǎo)致患者生存率較低[2,3]。多糖作為天然高分子聚合物及其衍生物，空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生物活性多樣[4]。許多研究表明，多糖在防止腫瘤發(fā)生和抑制腫瘤生長(zhǎng)中具有良好的效果[5]，其能夠通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞中多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和癌基因的表達(dá)，從而改變細(xì)胞膜流動(dòng)性，抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，以及誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和周期阻滯等[6-8]。

本課題組長(zhǎng)期致力于從真菌發(fā)酵液中分離和發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤作用的活性多糖，在廣泛的篩選中我們發(fā)現(xiàn)，從蘋果鏈格孢菌發(fā)酵液中分離出的胞外多糖具有良好的抗腫瘤活性[9]，這提醒我們植物病原菌可能是抗腫瘤活性多糖的一個(gè)重要來(lái)源。禾谷鐮刀菌又名禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)，能夠侵染小麥，致使病穗上出現(xiàn)粉紅色或橘紅色的霉?fàn)钗?，引發(fā)植物赤霉病[10,11]。本研究首次從禾谷鐮刀菌發(fā)酵液中分離得到禾谷鐮刀菌胞外多糖，經(jīng)過(guò)體外篩選發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GEPS能夠顯著抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖。本文通過(guò)對(duì)禾谷鐮刀菌胞外多糖體外抗胃癌SGC-7901作用及其機(jī)制的探究，為開發(fā)抗胃癌活性多糖藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與材料

1.1.1 主要儀器

LC-20AP半制備高效液相色譜儀(日本Shimadzu)；Epoch全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek)；G3000pwxl型色譜柱(日本TOSOH BIOSCIENCE)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)SIM INTERNATIONAL GROUP)；FACSVerse流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton,Dickinson and Company)；BX53熒光正置顯微鏡，IX51熒光倒置顯微鏡(日本Olympus Corporation)；WIX-miniPR02迷你垂直電泳槽，WIX-miniBLOT迷你轉(zhuǎn)印槽，WIX-EP600通用電泳儀電源(偉克斯科技有限公司)；Amersham Imager 600全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)General Electric Company)。

1.1.2 主要試劑

RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Cat.NO.：8121075，GIBCO公司)；胎牛血清(Cat.NO.：S711-001S，LONSA SCIENCE SRL公司)；CCK-8試劑盒(Cat.NO.：C0037)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Cat.NO.：C1062M)、Hoechst 33258染色試劑盒(Cat.NO.：C0003)、JC-1(Cat.NO.：C2006)、SDS-PAGE配膠試劑盒(Cat.NO.：P0012A)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液5×(Cat.NO.：P0015)、BCA試劑盒(Cat.NO.：P0009)、RIPA裂解液(Cat.NO.：P0013B)購(gòu)自碧云天生物科技公司；彩色預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(Cat.NO.：26616，Thermo Science公司)；Bcl-2(Cat.NO.：A0208)、Bax(Cat.NO.：A7626)、Cleaved Caspase-3(Cat.NO.：A0214)、Cleaved Caspase-9(Cat.NO.：A2636)、ACTB(Cat.NO.：AC026)抗體購(gòu)自ABclone Technology公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與菌種

人胃癌細(xì)胞SGC-7901(Cat.NO.：C6795)、BGC-823(Cat.NO.：C6123)和MGC-803(Cat.NO.：C6582)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，已在原公司完成細(xì)胞STR鑒定；禾谷鐮刀菌菌種來(lái)自于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所齊軍山研究員饋贈(zèng)，細(xì)胞及菌種現(xiàn)保存于安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 禾谷鐮刀菌的培養(yǎng)和發(fā)酵

PDA培養(yǎng)基配制[12]：200 g馬鈴薯切碎并加水煮沸30 min，紗布過(guò)濾后加入17 g瓊脂并加熱溶解，繼續(xù)加入15 g葡萄糖后補(bǔ)水至1 L，分裝后高壓蒸汽滅菌。液體培養(yǎng)基配制[13]：葡萄糖10 g，酵母膏2 g，0.5 g KH2PO4，0.5 g MgSO4·7H2O，0.25 g CaCl2，加純水定容至1 L。300 mL錐形瓶分裝，每瓶200 mL，滅菌備用。菌種使用PDA平面培養(yǎng)基在28 ℃恒溫培養(yǎng)，并活化3～5天，在菌絲長(zhǎng)勢(shì)良好但未產(chǎn)生孢子前，挑取邊緣菌絲接入液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min的條件下恒溫發(fā)酵培養(yǎng)7天[14,15]。

1.2.2 FGEPS的制備

發(fā)酵液過(guò)濾去除菌絲體，60 ℃減壓濃縮，加入四倍體積95%乙醇混勻，4 ℃下靜置12 h。離心保留沉淀并加入超純水在60 ℃加熱溶解，再次離心后保留上清。D101大孔樹脂脫色[16]，蒽酮硫酸法檢測(cè)并收集洗脫液，進(jìn)一步使用Sevage試劑法[17](V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1，V多糖溶液∶VSevage試劑= 4∶1)對(duì)多糖溶液進(jìn)行脫蛋白。0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后，使用再生纖維素透析袋(截留分子量3 500 Da)于4 ℃下透析72 h，收集截留液冷凍干燥得到胞外多糖FGEPS。

1.2.3 紅外和紫外光譜掃描

FGEPS使用KBr壓片，并于傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍進(jìn)行掃描[18]。精密稱取FGEPS使用超純水配制成5 mg/mL溶液，使用紫外可見分光光度計(jì)在190～400 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描。

1.2.4 高效凝膠滲透色譜

采用高效尺寸排阻色譜法測(cè)定分析FGEPS，色譜條件：RID-10A示差折光檢測(cè)器，G3000pwxl型色譜柱(內(nèi)徑×長(zhǎng)度：7.8 mm × 30 cm，東曹株式會(huì)社)，柱溫40 ℃，流速0.7 mL/min，流動(dòng)相為超純水，定量環(huán)20 μL，樣品濃度5 mg/mL。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)及CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖抑制

人胃癌細(xì)胞系SGC-7901、BGC-823和MGC-803細(xì)胞株使用1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%雙抗的1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基)培養(yǎng)，在5%的CO2、37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)可用于實(shí)驗(yàn)。

取對(duì)數(shù)期SGC-7901細(xì)胞，培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。每孔加入100 μL細(xì)胞懸液(5×104個(gè)/mL)，培養(yǎng)箱中孵育12 h待細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入100 μL含有不同濃度FGEPS的完全培養(yǎng)基，使其終濃度為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL(每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。BGC-823和MGC-803細(xì)胞的培養(yǎng)、給藥處理及增殖抑制測(cè)定的方法同上。

式中，A對(duì)照組：不含藥物組的吸光度；A給藥組：加入各濃度FGEPS處理組的吸光度。

1.2.6 細(xì)胞形態(tài)分析

取對(duì)數(shù)期SGC-7901細(xì)胞，六孔板每孔加入1 mL細(xì)胞懸液(3×105個(gè)/mL)，吹打分散均勻。貼壁后棄去培養(yǎng)基并以PBS潤(rùn)洗后，加入1 mL含F(xiàn)GEPS完全培養(yǎng)基(0、0.5、1.0、1.5 mg/mL)，處理24 h后，使用倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.2.7 Hoechst 33258染色

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1.5×105個(gè)/mL。在6孔板中放置細(xì)胞爬片蓋玻片，每片上加入細(xì)胞懸液200 μL繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后在細(xì)胞密度為50%～80%時(shí)，棄去培養(yǎng)基并加入含F(xiàn)GEPS(0、0.5、1.0、1.5 mg/mL)完全培養(yǎng)基。處理24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入0.5 mL固定液在4 ℃下固定12 h。棄去固定液后，PBS清洗兩遍。加入0.5 mL的Hoechst 33258染色液，染色5 min。PBS清洗兩遍，抗熒光淬滅封片液封片，使用正置熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.8 AnnexinV-FITC/PI染色

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞，六孔板每孔加入1 mL細(xì)胞懸液(3×105個(gè)/mL)。貼壁后棄去培養(yǎng)基并以PBS潤(rùn)洗，分別加入1 mL含F(xiàn)GEPS的完全培養(yǎng)基(0、0.5、1.0、1.5 mg/mL)。處理24 h后消化、離心收集細(xì)胞。結(jié)合液重懸分散細(xì)胞后，各組依次加入5 μL的AnnexinV-FITC熒光探針和10 μL的PI染液，混勻后在20～25 ℃下避光孵育20 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)lowjo軟件分析。

1.2.9 JC-1染色

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至3×105個(gè)/mL。在6孔板中放置蓋玻片，每孔加入細(xì)胞懸液1 mL繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后在細(xì)胞密度為50%～80%時(shí)，棄去培養(yǎng)基并加入含F(xiàn)GEPS完全培養(yǎng)基(0、0.5、1.0、1.5 mg/mL)。處理24 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入1 mL胰酶消化液(不含EDTA)消化細(xì)胞，待消化結(jié)束后移除胰酶消化液，加入新的培養(yǎng)液，吹打后慢速離心收集細(xì)胞，0.5 mL培養(yǎng)液重懸后加入0.5 mL JC-1染色工作液，輕彈混勻，37 ℃孵育20 min。孵育結(jié)束后用預(yù)冷的JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次并重懸，使用流式細(xì)胞儀分析。

1.2.10 Western blot

取對(duì)數(shù)期SGC-7901細(xì)胞，培養(yǎng)于6孔板中。每孔加入1 mL細(xì)胞懸液(5×105個(gè)/mL)。貼壁后，棄去培養(yǎng)基并以PBS潤(rùn)洗，分別加入1 mL含F(xiàn)GEPS的完全培養(yǎng)基(0、0.5、1.0、1.5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基冰上裂解后，4 ℃下以12 000 g離心10 min，提取細(xì)胞總蛋白。BCA法調(diào)整各組樣品蛋白濃度后，按體積比4∶1將樣品蛋白與上樣緩沖液5×混合后，煮沸變性。實(shí)驗(yàn)組每孔上樣蛋白20 μg，體積10 μL，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗孵育(1∶1 000稀釋)和二抗(1∶10 000稀釋)孵育，使用化學(xué)發(fā)光顯影曝光，Image J軟件分析。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和描述，使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，多組均數(shù)的比較，使用單因素方差分析，兩組間差異采用Dunnett-t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖提取及分離

如圖1所示，禾谷鐮刀菌菌種活化后長(zhǎng)勢(shì)良好，挑取邊緣菌絲接種到共8 L液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵7天后收集發(fā)酵液，經(jīng)過(guò)醇沉、脫色、脫蛋白、透析和凍干后，得到禾谷鐮刀菌胞外多糖670 mg，多糖得率為83.75 mg/L。

圖1 禾谷鐮刀菌胞外多糖的制備Fig.1 Preparation of FGEPS

2.2 IR、UV光譜分析

圖2A為FGEPS的紅外光譜。3 600～3 200 cm-1處的吸收帶是-OH的伸縮振動(dòng)吸收峰，此區(qū)域的吸收峰為糖類的特征吸收峰。3 377 cm-1為O-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，是糖類的特征峰；2 929 cm-1處的吸收峰是多糖的C-H伸縮振動(dòng)；1 649 cm-1處的吸收峰為結(jié)晶水引起；1 539 cm-1處的吸收峰為C=O的伸縮振動(dòng)峰；1 415 cm-1處的吸收峰是C-O的伸縮振動(dòng)峰；1 030 cm-1處的吸收峰為O-H的變角振動(dòng)引起。紅外光譜表明通過(guò)方法“1.2.2”制備最終得到的成分是多糖。如圖2B所示，F(xiàn)GEPS在260～280 nm內(nèi)無(wú)紫外吸收，表明該多糖中不含有多肽及核酸類物質(zhì)。

圖2 FGEPS的紅外和紫外光譜Fig.2 Infrared and ultraviolet spectra of FGEPS

2.3 HPGPC分析

脫色脫蛋白及透析處理后的禾谷鐮刀菌胞外多糖，經(jīng)HPGPC分析顯示共有四個(gè)組分，結(jié)合紅外光譜表明該物質(zhì)是多糖成分，紫外掃描顯示不含有多肽核酸類物質(zhì)，經(jīng)透析去除3 500 Da分子量以下的物質(zhì)，因此該色譜圖出峰均為多糖物質(zhì)引起。如圖3所示，HPGPC表明FGEPS含有四個(gè)組分。1號(hào)峰保留時(shí)間(retention time，tR)為8.207 min，峰面積占比75.99%；2號(hào)峰tR=9.637 min，峰面積占比17.86 %；3號(hào)峰tR=10.079 min，峰面積占比3.45 %、4號(hào)峰tR=10.212 min，峰面積占比2.70 %。從保留時(shí)間來(lái)看，1號(hào)峰保留時(shí)間最短，組分相對(duì)分子量最大。結(jié)合各組分含量占比分析，F(xiàn)GEPS發(fā)揮生物學(xué)活性的成分可能主要是1號(hào)峰所在的組分。

圖3 FGEPS的高效凝膠滲透色譜Fig.3 High performance gel permeation chromatography of FGEPS

2.4 細(xì)胞增殖

如圖4所示，使用不同濃度的FGEPS分別處理人胃癌SGC-7901、BGC-823和MGC-803細(xì)胞24 h后，相比對(duì)照組，F(xiàn)GEPS在濃度為0.8 mg/mL之后，能夠顯著抑制三種胃癌細(xì)胞的增殖(P< 0.05或P< 0.01)，在2 mg/mL時(shí)對(duì)SGC-7901、BGC-823和MGC-803細(xì)胞的抑制率分別為(43.86 ± 8.57)%、(36.21 ± 2.52)%和(33.45 ± 2.18)%。由圖4知FGEPS對(duì)三種人胃癌細(xì)胞的增殖均有抑制作用，而對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制效果最顯著，且具有濃度依賴性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇SGC-7901細(xì)胞為研究對(duì)象。

圖4 FGEPS對(duì)SGC-7901、BGC-823和MGC-803細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of FGEPS on proliferation of SGC-7901,BGC-823 注：與SGC-7901對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與BGC-823對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與MGC-803對(duì)照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。Note:Compared with SGC-7901 control group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with BGC-823 control group,#P<0.05,##P<0.01;Compared with MGC-803 control group,△P<0.05,△△P<0.01.

2.5 細(xì)胞形態(tài)

如圖5可見，正常組細(xì)胞形態(tài)清晰，數(shù)量較多。給予FGEPS處理后，細(xì)胞均呈現(xiàn)皺縮、變形，細(xì)胞膜出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，甚至出現(xiàn)死細(xì)胞。1.5 mg/mL的FGEPS處理組，細(xì)胞由于凋亡使得活細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞嚴(yán)重收縮變形。結(jié)果表明，F(xiàn)GEPS可導(dǎo)致SGC-7901細(xì)胞收縮變形、細(xì)胞膜發(fā)泡。

2.6 Hoechst 33258染色

細(xì)胞染色質(zhì)經(jīng)過(guò)Hoechst 33258染色后，在熒光顯微鏡下正常細(xì)胞的細(xì)胞核為藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞由于染色質(zhì)固縮呈現(xiàn)致密濃染，顏色發(fā)白并較為明亮。如圖6所示，隨著給藥劑量的增加，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象加重，出現(xiàn)較多的凋亡小體。此外在1.5 mg/mL時(shí)，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞核明顯縮小。

2.7 Annexin V-FITC雙染

細(xì)胞凋亡早期時(shí)磷脂酰絲氨酸外翻，能夠被Annexin V-FITC結(jié)合。而壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性后的細(xì)胞核能夠被碘化丙啶(propidium iodide，PI)結(jié)合。如圖7所示，隨著FGEPS劑量的增大，SGC-7901細(xì)胞凋亡率顯著增加，對(duì)比對(duì)照組，1.0 mg/mL時(shí)凋亡率為(12.18 ± 2.16)%(P<0.01)，1.5 mg/mL時(shí)，凋亡率為(15.69 ± 0.51)%(P<0.001)。結(jié)果表明，F(xiàn)GEPS能夠誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡，并伴有濃度依賴性。

2.8 JC-1染色

線粒體膜電位(ΔΨm)的下降是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志之一，JC-1是一種良好的熒光探針，當(dāng)膜電位較高時(shí)，JC-1聚合于基質(zhì)中產(chǎn)生紅色熒光；而當(dāng)膜電位較低時(shí)，JC-1以單體形式存在，發(fā)出綠色熒光。如圖8所示，隨著FGEPS劑量的增大，SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位水平顯著降低，與對(duì)照組相比，1.0 mg/mL時(shí)的線粒體膜電位水平為(10.73±1.16)%(P<0.05)，給藥濃度為1.5 mg/mL時(shí)，膜電位水平為(12.1±1.83)%(P<0.01)。結(jié)果表明，F(xiàn)GEPS能夠顯著降低SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位水平，并伴有濃度依賴性。

圖5 FGEPS對(duì)SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的影響(×200)Fig.5 Effect of FGEPS on the morphology of SGC-7901 cells

圖6 FGEPS對(duì)SGC-7901細(xì)胞染色質(zhì)的影響(×400)Fig.6 Effect of FGEPS on chromatin of SGC-7901 cells

圖7 FGEPS對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響Fig.7 Effect of FGEPS on apoptosis of SGC-7901 注：與對(duì)照組比較，**P<0.01，***P<0.001。Note:Compared with control group,**P<0.01,***P<0.001.

2.9 Western blot

如圖9所示，對(duì)比空白組，F(xiàn)GEPS能夠顯著上調(diào)SGC-7901細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9表達(dá)(P<0.01或P<0.001)，并下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)(P<0.001)，表明線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑在FGEPS誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

3 討論與結(jié)論

天然產(chǎn)物一直是醫(yī)藥開發(fā)的寶庫(kù)，在疾病治療中發(fā)揮著巨大作用，就抗腫瘤而言，如紫杉醇、喜樹堿、鬼臼毒素、長(zhǎng)春堿等，這些天然藥物不僅具有應(yīng)用效果，同時(shí)也為新化合物的合成提供了思路和參考[19-21]。真菌發(fā)酵過(guò)程中次級(jí)代謝產(chǎn)物是活性多糖的重要來(lái)源，從黑根霉發(fā)酵液中分離得到的胞外多糖EPS，通過(guò)激活小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞中的AMP活化蛋白激酶(AMPK)途徑，以劑量和時(shí)間依賴性的方式抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[22]；擬康氏木霉胞外多糖以劑量依賴性方式增加Caspase-9和Caspase-3的活性，增加Bax/Bcl-2的比例，促進(jìn)細(xì)胞色素C(Cyt-C)向細(xì)胞質(zhì)釋放，通過(guò)固有線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡[23]；蘋果鏈格孢菌胞外多糖能夠增加胃癌BGC-823細(xì)胞的活性氧水平，降低線粒體膜電位并形成凋亡小體[9]。本研究中能夠有效抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的FGEPS正是從禾谷鐮刀菌發(fā)酵液中分離得到，CCK-8實(shí)驗(yàn)表明FGEPS能夠有效抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖，細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果表明FGEPS能夠引起SGC-7901細(xì)胞收縮變形、胞膜發(fā)泡，甚至形成凋亡小體，而這些現(xiàn)象正是細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)。AnexinV-FITC/PI雙染、Hoechst 33258染色及JC-1的染色結(jié)果表明FGEPS可誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡，并可能與線粒體介導(dǎo)的途徑有關(guān)。由于細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自身程序性死亡，涉及一系列基因的調(diào)控[24]，因此根據(jù)相關(guān)結(jié)果，我們研究了線粒體途徑在FGEPS誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡中的作用。

圖8 FGEPS對(duì)SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.8 Effect of FGEPS on mitochondrial membrane potential of SGC-7901 注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01.

圖9 FGEPS對(duì)SGC-7901細(xì)胞Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effect of FGEPS on the expression of Bax,Bcl-2,Cleaved Caspase-3 and Cleaved Caspase-9 proteins in SGC-7901 注：與對(duì)照組比較，**P<0.01，***P<0.001。Note:Compared with control group,**P<0.01,***P<0.001.

通過(guò)對(duì)引起凋亡作用機(jī)制的探討，我們發(fā)現(xiàn)FGEPS能夠顯著上調(diào)促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表達(dá)，并下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)，這顯示線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與FGEPS發(fā)揮抗人胃癌SGC-7901作用關(guān)系密切。線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要是指在凋亡信號(hào)的刺激下，抑凋亡蛋白Bcl-2和凋亡蛋白家族中Bax比率失衡，Bax的過(guò)表達(dá)引起線粒體膜通透性增加，釋放出Cyt-C等因子，在與凋亡蛋白酶活化因子結(jié)合后，能夠激活凋亡蛋白酶Caspase-9，促使半胱天冬氨酸與其結(jié)合，從而形成凋亡小體。Caspase是一組龐大的凋亡蛋白酶家族，能夠通過(guò)線粒體途徑被激活，而活化的Caspase還能夠引起線粒體釋放出更多的Cyt-C，該家族“瀑布式”的激活鏈將最終引起細(xì)胞走向凋亡。Caspase-9處于“瀑布式”激活鏈的頂端，被激活后的Caspase-9將引起下游Caspase-3等效應(yīng)分子的活化，引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞核染色質(zhì)固縮、裂解以及和胞體分離形成凋亡小體等[25-27]。本研究發(fā)現(xiàn)FGEPS能夠誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡，且線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑在FGEPS誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡過(guò)程中具有重要作用。多糖作為天然高分子物質(zhì)，不只是結(jié)構(gòu)、能量物質(zhì)的基本成分，更是參與機(jī)體調(diào)控、應(yīng)答的關(guān)鍵分子[28-30]。隨著糖生物學(xué)的發(fā)展，多糖因?yàn)榫哂辛己玫目鼓[瘤活性而成為抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)。

綜上所述，本研究首次從禾谷鐮刀菌中分離出胞外多糖FGEPS，其對(duì)SGC-7901、BGC-823和MGC-803均有增殖抑制效果，且對(duì)SGC-7901抑制效果最為顯著，并能通過(guò)線粒體通路誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡。實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探討FGEPS抗胃癌作用的研究提供依據(jù)，為開發(fā)多糖類胃癌輔助治療藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。