梁夢夢，邵欣欣，陳聰，張松，張廣忠，李佳*

(1. 山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355；2. 濟南玖玫玫瑰有限公司，山東 濟南 250400)

抑郁癥是一種以顯著而持久的心情低落為主要臨床癥狀的常見病，患者通常表現(xiàn)為興趣明顯減少、存在睡眠障礙，嚴重者會出現(xiàn)自殘、自殺傾向[1]。據世界衛(wèi)生組織估計，世界上患有抑郁癥的總人數(shù)達3.22億，其中近一半的人生活在東南亞和西太平洋區(qū)域，反映出這兩個區(qū)域人數(shù)相對較多[2]。

目前傳統(tǒng)抗抑郁藥雖有一定療效，但普遍存在復發(fā)率高、治愈率低、副作用大等問題[3]，開發(fā)治療抑郁癥的新藥顯得尤為重要。中醫(yī)藥治療抑郁癥以藥理成分多、多靶點治療、毒副作用小為特點，具有“增效減副”的優(yōu)勢[4]。

玫瑰花為薔薇科植物玫瑰RosarugosaThunb.的干燥花蕾，性溫，味甘、微苦，入肝脾二經，具有行氣解郁、和血、止痛之功，可用于治療肝胃氣痛、食少嘔惡、月經不調、跌撲傷痛等癥[5]，主產于山東平陰?，F(xiàn)代藥理研究亦表明，玫瑰花所含有的黃酮類、維生素、氨基酸、揮發(fā)油等成分，具有抗抑郁、抗腫瘤、抗氧化、抑菌、調節(jié)血脂、降血糖等藥理活性[6-7]。但是，玫瑰花抗抑郁的物質基礎及作用機制尚不夠明確。因此，本研究借助網絡藥理學方法，對玫瑰花抗抑郁物質基礎及作用機制進行研究，旨在為抗抑郁新藥研發(fā)提供理論依據及新的研究思路。

1 資料來源與篩選標準

1.1 抗抑郁單體收集與篩選

本研究選擇信息比較全面的中國知網(China national knowledge infrastructure，CNKI)數(shù)據庫為數(shù)據來源，以“TKA =‘抗抑郁’and TKA =‘單體’”為檢索式。其中，文獻的納入標準：(1)實驗性論文和專利；(2)實驗步驟的各項信息較完整；(3)有明確的抗抑郁作用的單體。排除標準：(1)實驗對象為單味藥、復方或中西藥聯(lián)用類論文；(2)綜述類文獻；(3)實驗數(shù)據或指標有誤的論文。收集并篩選符合標準的抗抑郁單體。

2 研究方法

2.1 化學結構相似性比對

將抗抑郁單體與玫瑰花化合物結構導入化學結構比對軟件Data Warrior中，進行基于結構片段的相似性比對，選擇大于95% 為相似度閾值[8]，得到其相似性比對的結果，以探索已具備研究基礎的化合物與玫瑰花化合物的相似程度，分析玫瑰花所含化合物臨床抗抑郁應用潛力。

2.2 玫瑰花的抗抑郁成分-靶點關聯(lián)分析

經抗抑郁單體和玫瑰花化合物結構相似性比對，獲得玫瑰花化合物中與抗抑郁單體具有高度結構相似性成分，對其相關靶點以Probability≥0.068為篩選標準，最終篩選出玫瑰花的抗抑郁成分，并預測其相關靶點，構建玫瑰花的抗抑郁成分-靶點數(shù)據庫。將經篩選后的玫瑰花的抗抑郁成分及對應靶點導入 VOS viewer 1.6.13進行關聯(lián)規(guī)則分析，繪制玫瑰花的抗抑郁成分與靶點關聯(lián)規(guī)則圖譜，分析玫瑰花的抗抑郁成分與靶點的內在聯(lián)系。借助頻數(shù)分析，統(tǒng)計高頻成分及靶點，繪制頻數(shù)分布圖。

2.3 構建玫瑰花成分-靶點-疾病網絡

2.3.1 玫瑰花的作用靶點蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建

將玫瑰花的抗抑郁成分作用靶點導入STRING(https://string-db.org)數(shù)據庫，并限定研究物種來源于人種(homo sapiens)，借助此蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)分析平臺構建 PPI 網絡。

2.3.2 玫瑰花的抗抑郁成分-靶點-疾病相互作用網絡構建

將玫瑰花的抗抑郁成分作用靶點導入DAVID (https://david.ncifcrf.gov)數(shù)據庫，借助DAVID子庫GAD進行疾病富集分析，構建靶點-疾病數(shù)據庫。將玫瑰花的抗抑郁成分-靶點數(shù)據庫、靶點-疾病數(shù)據庫及上述PPI數(shù)據庫，導入網絡可視化軟件 Cytoscape3.7.2，并進行融合，構建玫瑰花的抗抑郁成分-靶點-疾病相互作用網絡。其中成分、靶點、疾病被表示為網絡中的節(jié)點，其之間的相互聯(lián)系以邊表示。

2.4 核心靶點篩選及核心成分-靶點-疾病相互作用網絡構建

利用DAVID 數(shù)據庫搜索關鍵詞“depression,”查找與抑郁癥相關的靶點，并構建抑郁癥-靶點數(shù)據庫。同玫瑰花抗抑郁成分-靶點數(shù)據庫合并，去除重復和假陽性的靶點，最后與活性成分相關的靶點相映射，獲得玫瑰花與抑郁癥相關的核心成分和相關靶點，構建玫瑰花抗抑郁核心成分-靶點數(shù)據庫。

將核心靶點導入STRING數(shù)據庫，限定研究物種來源于人種(homo sapiens)，構建核心靶點 PPI 相互作用網絡，將該相互作用關系同抑郁癥-靶點數(shù)據庫、玫瑰花的抗抑郁核心成分-靶點數(shù)據庫分別導入Cytoscape3.7.2，合并，以構建核心成分-核心靶點-疾病相關作用網絡，其中玫瑰花的核心成分、核心靶點、疾病被表示為網絡中的節(jié)點，其之間的相互聯(lián)系以邊表示。

2.5 通路富集分析

將玫瑰花的核心靶點導入 DAVID數(shù)據庫進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG) 通路富集分析，閾值為P<0.01，限定研究物種來源于人種(homo sapiens)。

2.6 分子對接

對玫瑰花核心成分及核心靶點以節(jié)點度值(degree)進行排布，篩選節(jié)點度值前三的靶點及成分為玫瑰花的抗抑郁關鍵靶點及關鍵成分，于蛋白質晶體庫PDB(https://www1.rcsb.org/)篩選出關鍵靶點相對應的蛋白質晶體結構，運用分子對接軟件Discovery Studio 2017 R2中的Receptor-Ligand International模塊，對玫瑰花關鍵靶點及關鍵成分分別進行CDOCKER分子對接。蛋白的活性位點以晶體結構中自身標注的原配體作用的活性氨基酸位點為中心，進行“活性口袋”構建，使小分子通過CDOCKER算法模塊與“活性口袋”中的氨基酸進行對接，參數(shù)設置：Pose Cluster Radius設置為0.5，Random Conformations 設置為10，Orientations to Refine設置為10，其余維持默認參數(shù)不變。

3 研究結果

3.1 玫瑰花的抗抑郁化學成分

經玫瑰花化學成分與抗抑郁單體結構片段相似性比對(圖1)篩選，結果顯示，玫瑰花成分中與抗抑郁單體具有高結構相似性(>95%)成分27個(詳見OSID附表1)，且主要為黃酮類、萜類、苯丙素類、甾體類、多酚類(表1)。

圖1 抗抑郁單體與玫瑰花成分相似結構性比對Fig.1 The similar structural comparison of antidepressant monomers and Rosae Rugosae Flos ingredients

表1 玫瑰花的抗抑郁相關化合物分類Table 1 Classification of antidepressant related compounds in Rosae Rugosae Flos

3.2 玫瑰花的抗抑郁成分與靶點的關聯(lián)關系

以玫瑰花的抗抑郁成分27個，對應作用靶點255個，構建玫瑰花的抗抑郁成分-靶點數(shù)據庫，并導入VOS viewer 1.6.13，發(fā)現(xiàn)由于化學成分結構的多樣性，從而導致其作用靶點的差異性(圖2)。如圖顯示，甾體類化合物與靶點P60568更為相關，萜類以及多酚類化合物與靶點Q14534、P04745更為相關，而黃酮類化合物以其天然的結構優(yōu)勢涉及多種藥理活性，提示此類化合物具備多樣的生物活性。

根據玫瑰花的抗抑郁活性成分及抑郁靶點關聯(lián)分析(圖2)，將顯著關聯(lián)結果進行頻數(shù)統(tǒng)計，得到玫瑰花的抗抑郁活性成分-靶點頻數(shù)分析圖(圖3)，結果顯示，C1成分(黃酮類化合物)和C5成分(酚酸類化合物)對于抑郁相關靶點均具備較高的特異性，其中黃酮類化合物覆蓋更多的靶點。

圖2 玫瑰花的抗抑郁活性成分-靶點關聯(lián)分析Fig.2 The correlation analysis of Rosae Rugosae Flos antidepression ingredients and targets

圖3 玫瑰花的抗抑郁活性成分-靶點頻數(shù)分析Fig.3 The frequency chart of Rosae Rugosae Flos antidepression ingredients and targets

3.3 玫瑰花的抗抑郁成分主要作用通路

以Cytoscape3.7.2構建玫瑰花抗抑郁成分-靶點-疾病相互作用網絡(圖4 (a))，結果顯示，來源于玫瑰花的27個成分與255個靶點發(fā)生相互作用，并與986種疾病產生關聯(lián)，其中包含抑郁癥。通過DAVID數(shù)據庫進行KEGG通路富集分析(圖4 (b))，發(fā)現(xiàn)玫瑰花的抗抑郁成分主要通過氮素代謝，類固醇激素生物合成，神經活性配體-受體的相互作用，花生四烯酸代謝等通路發(fā)揮治療疾病的作用。

注:(a)中紅色為27個玫瑰花抗抑郁成分，玫紅色為255個與玫瑰花發(fā)生相互作用的靶點，藍色為與255個靶點相關聯(lián)的986種疾病(其中包括抑郁癥)。圖4 玫瑰花的抗抑郁成分-靶點-疾病相互作用網絡及其抑郁相關靶點KEGG通路分析Fig.4The antidepression ingredients-targets-disease interaction network and the depression-related targets-path analysis of Rosae Rugosae Flos

3.4 玫瑰花抗抑郁核心靶點及核心成分

從玫瑰花的抗抑郁成分-靶點-疾病相互作用網絡(圖4(a))中篩選出與抑郁相關的子網絡(玫瑰花的抗抑郁核心成分-靶點-疾病相互作用網絡)，將核心靶點 PPI關系同抑郁癥-靶點數(shù)據庫、玫瑰花的抗抑郁核心成分-靶點數(shù)據庫分別導入Cytoscape3.7.2，合并，構建玫瑰花的抗抑郁核心成分-核心靶點-疾病相關作用網絡(圖5 )。圖5 網絡中有節(jié)點48個(核心成分17個，核心靶點31個)，包含194條邊。借助KEGG對玫瑰花抗抑郁核心靶點進行通路富集分析，得到圖6，發(fā)現(xiàn)玫瑰花治療抑郁癥的活性成分主要通過HIF-1 信號通路、神經活性配體-受體相互作用信號通路、催乳素信號通路、多巴胺能神經突觸等通路發(fā)揮作用。

注:黃色表示玫瑰花，紅色表示玫瑰花抗抑郁核心成分(TCMSP 編號活性成分和來自文獻自擬編號成分)，藍色表示玫瑰花治療抑郁癥潛在靶點。圖5 玫瑰花的抗抑郁核心成分-靶點-疾病相互作用網絡Fig.5 The antidepression core ingredients-targets-disease interaction network

圖6 玫瑰花抗抑郁核心靶點KEGG通路分析Fig.6 KEGG pathway analysis for the depression-related core targets of Rosae Rugosae Flos

將抗抑郁核心成分與其作用核心靶點進行頻數(shù)統(tǒng)計分析，得到抗抑郁核心成分-靶點頻數(shù)分析圖(圖7)，結果顯示，黃酮類化合物及其相對應的靶點具備更高的特異性。

圖7 抗抑郁核心成分-靶點頻數(shù)分析Fig.7 The frequency chart of antidepression core ingredients-targets

3.5 玫瑰花抗抑郁關鍵靶點及關鍵成分

以節(jié)點度值進行排布，結果顯示節(jié)點度值前三的靶點在抑郁癥相關子網絡中具備突出作用，活性成分degree≥18的具備更好的生物活性。因此，靶點P31749、P35354、P03372、P01375為玫瑰花的抗抑郁關鍵靶點，活性成分124(來自文獻[9]，編號自擬)、MOL000007、MOL000008、MOL000098、MOL000206、MOL000415、MOL000422、MOL000437、MOL004799(來自TCMSP數(shù)據庫，與數(shù)據庫提供編號一致)為抗抑郁關鍵成分(結構見圖8)。

圖8 玫瑰花抗抑郁關鍵成分結構圖Fig.8 The structure chart of the key antidepressant components of Rosae Rugosae Flos

3.6 分子對接結果

為進一步確認玫瑰花所含抗抑郁成分及其作用靶點，將抗抑郁核心成分、核心靶點進行分子對接，發(fā)現(xiàn)9個核心成分中僅有6個成分可與其相關靶點進行對接(表2)。分子對接打分值越高表示吻合性越好，分析發(fā)現(xiàn)成分MOL000008，MOL000098，MOL000422與靶點P31749的結合最好(圖9)，成分MOL000008，MOL000206，MOL000422與靶點P31749、P03372也可較好結合(圖10～11)。

表2 核心靶點分子對接Table 2 Molecular docking results of core targets

圖9 靶點P31749 分子對接可視化結果Fig.9 Molecular docking visualization results of target P31749

圖10 靶點P35354分子對接可視化結果Fig.10 Molecular docking visualization results of target P35354

圖11 靶點P03372分子對接可視化結果Fig.11 Molecular docking visualization results of target P03372

4 討論

經研究初步判定，玫瑰花所含成分中黃酮類化合物在發(fā)揮抗抑郁作用方面更具顯著特異性。玫瑰花的抗抑郁活性成分-靶點頻數(shù)分析結果顯示(圖3)，C1成分(黃酮類化合物)和C5成分(酚酸類化合物)對于抑郁相關靶點均具備較高的特異性，且黃酮類化合物覆蓋更多的靶點。大量報道證明，酚酸類化合物受生物利用度的影響和制約[10]，說明其成藥性差，因而不作為首選研究藥物和臨床前體藥物研究的參考。進一步針對玫瑰花抗抑郁核心靶點和核心成分進行分析，發(fā)現(xiàn)僅有黃酮類化合物發(fā)揮高度特異性(圖7)。

迄今為止，從玫瑰花中共分離和檢測到的所有成分中黃酮類化合物占比較高，約占40.87%[11]，研究發(fā)現(xiàn)該類化合物與抗抑郁化合物顯示出高度結構相似性。通過片段結構相似性比對，設置篩選條件為高度結構相似性≥95%，結合其結構特性及相對應的靶點和分子對接結果，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物及其相對應的靶點具備更高的特異性。另外已有研究表明，大量的黃酮類物質具有抗抑郁作用，槲皮素[12]和蘆丁[13]可通過降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)的表達量，緩解抑郁樣行為；山柰酚、芹菜素[14-15]則能通過抑制單胺氧化酶(MAO)的表達，顯示出抗抑郁活性；金絲桃苷通過影響5-HT系統(tǒng)，顯示出抗抑郁作用[16]。然而，玫瑰花作為藥食同源中藥材之一，具有安全有效的優(yōu)勢，其抗抑郁作用機理的研究不足嚴重影響了具有較高藥用價值和經濟價值[17]的玫瑰花藥用開發(fā)。

藥物的藥效成分不僅作用于相關靶點，還可以影響靶點相關多個信號通路與代謝途徑，進而干擾特定疾病的發(fā)生發(fā)展。本次研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素、山柰酚均可作用于靶點AKT1、PTGS2、ESR1，異丁香酚可作用于PTGS2、ESR1，槲皮素可作用于AKT1，異槲皮苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷均可作用于PTGS2。已有研究證實，參與神經生物學過程的蛋白激酶是情感障礙藥物治療、預后、診斷的新靶點[18]。蛋白激酶AKT1是蛋白激酶B的一種亞型，對神經系統(tǒng)細胞的發(fā)育、生長和存活起著重要作用，當其在神經系統(tǒng)中的表達顯著上調，大鼠抑郁樣行為具有明顯的緩解趨勢[19]。AKT1P還參與到與各種生長因子相關的HIF-1信號通路[20]、與催乳素受體相關的催乳激素信號通路[21]、與神經遞質相關的多巴胺能神經突觸通路當中，這些通路可能是芹菜素、山柰酚、槲皮素作用于靶點AKT1發(fā)揮抗抑郁功效的作用機制。大量證據表明炎癥過程和氧化應激反應是抑郁癥發(fā)病的主要機制，在抑郁癥中起著重要的作用，抑郁癥所伴隨的神經退行性加重，部分是由炎癥過程引起的[22]。PTGS2是一種炎性相關酶，在慢性炎癥組織中發(fā)揮關鍵作用，參與中樞神經系統(tǒng)神經退行性病變相關的炎癥過程[23]。而PTGS2基因編碼的環(huán)氧合酶-2與MDD發(fā)病機制有關[24]。COX-2抑制劑還可以通過調節(jié)細胞因子和PGE2發(fā)揮抗抑郁作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)玫瑰花抗抑郁作用靶點PTGS2參與到催乳激素信號通路當中，此通路可能是芹菜素、異丁香酚、山柰酚作用于靶點PTGS2發(fā)揮抗抑郁功效的作用機制。有研究顯示，ESR1基因的TT等位基因RS2234693與慢性或重度抑郁癥有關[26]。新生兒氯丙咪嗪治療顯著誘導下丘腦中ESR1 mRNA表達增加，并且新生兒氯丙咪嗪治療(在大腦發(fā)育期間)誘導了參與調節(jié)抑郁樣行為的不同腦區(qū)雌激素受體的變化[27]。經 KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)玫瑰花抗抑郁作用靶點ESR1可通過催乳激素信號通路發(fā)揮抗憂郁作用。此通路可能是芹菜素、異丁香酚、山柰酚作用于靶點ESR1發(fā)揮抗抑郁功效的作用機制。

本研究借助網絡藥理學方法，以結構相似性顯著的成分為基礎，采用分子對接技術，對玫瑰花抗抑郁物質基礎及作用機制進行研究，旨在為明晰玫瑰花抗抑郁作用機理提供理論基礎，為抗抑郁新藥研發(fā)提供理論依據及新的研究思路。