黃永橋 馬 凱 吳新文 高 亮 簡銀池 路 瑤 楊昌彪

(1. 貴州省檢測技術(shù)研究應用中心，貴州 貴陽 550014；2. 貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽 550014)

米酵菌酸(Bongkrekic Acid)是椰毒假單胞菌屬酵米面亞種產(chǎn)生的一種可以引起食物中毒的毒素，毒性較強，誤食后會損壞人的腦、肝臟及腎等器官，嚴重者可致死亡[1-2]，其化學結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 米酵菌酸的化學結(jié)構(gòu)式Figure 1 The chemical structure formula of bongkrekic acid

近年來，中國因米酵菌酸引起的食物中毒事件時有發(fā)生[3-5]。黑木耳本身無毒，但長時間浸泡會變質(zhì)滋生細菌、真菌等致病微生物，進而產(chǎn)生生物毒素(米酵菌酸)，危害人體健康。目前，中國現(xiàn)行的相關(guān)標準中只規(guī)定了銀耳中米酵菌酸含量≤ 0.25 mg/kg[6-7]，現(xiàn)行的米酵菌酸檢測標準中檢出限為0.005 mg/kg[8]，且標準適用范圍為銀耳及其制品、酵米面及其制品等食品，而黑木耳未在其檢測范圍內(nèi)且限量不明確。

目前，有關(guān)米酵菌酸含量檢測的方法有薄層色譜法[9]、紫外分光光度法[10]、高效液相色譜法[11-12]、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[13-15]、高分辨質(zhì)譜法[16]。薄層色譜法和紫外分光光度法操作簡單，但易受其他雜質(zhì)的干擾；高效液相色譜法通用性強，但靈敏度低；液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法因具有靈敏度高、抗干擾能力強等優(yōu)點，被廣泛用于痕量分析。而有關(guān)黑木耳中米酵菌酸含量的測定方法尚未見報道。QuEChERS法作為近年來新開發(fā)的一種快速、簡便的前處理方法，被廣泛用于農(nóng)獸藥殘留及其他痕量化合物的測定[17-20]。

研究擬以黑木耳為研究對象，采用QuEChERS凈化方法，建立QuEChERS結(jié)合UHPLC-MS/MS儀快速測定黑木耳中米酵菌酸含量的檢測方法，旨在為黑木耳的質(zhì)量控制提供一種更加快速、簡便的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器和試劑

超高效液相色譜儀：Agilent 1290型，配ZORBAX Eclipse Plus C18(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm)，美國安捷倫科技有限公司；

三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：6470型，配有電噴霧離子源，美國安捷倫科技有限公司；

多管渦旋混合器：UMV-2型，北京普立泰科公司；

純水機：Milli-Q型，美國Millipore公司；

陶瓷均質(zhì)子：北京迪科馬科技有限公司；

C18吸附劑：40～63 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司；

無水硫酸鎂：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

甲醇、乙腈：色譜級，德國Merck公司；

氨水：分析純，山東西亞化工科技有限公司；

乙酸銨(質(zhì)量分數(shù)25%～28%)：色譜純，山東西亞化工科技有限公司；

米酵菌酸：≥95%，美國Sigma公司；

黑木耳：試驗前于30 ℃下恒溫避光浸泡48 h，市售。

1.2 標準溶液配制

1.2.1 標準儲備液配制 將米酵菌酸標準品配制成1.0 mg/mL標準儲備液，于-18 ℃避光保存。

1.2.2 基質(zhì)工作曲線配制 將樣品前處理后得到的空白基質(zhì)提取液，分別配置成0.50，1.00，2.00，4.00，8.00，10.00 ng/mL基質(zhì)標準工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 色譜條件

柱溫35 ℃；進樣量5 μL；流動相A為2 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸溶液)，流動相B為乙腈；流速0.3 mL/min；洗脫梯度：0.0～0.5 min，10% B；0.5～1.5 min，10%～85% B；1.5～2.0 min，85% B；2.0～2.5 min，85%～10% B；2.5～4.0 min，10% B。

1.4 質(zhì)譜條件

ESI源；負離子掃描；MRM掃描；毛細管電壓4.0 kV；霧化器壓力275.8 kPa；干燥氣和鞘氣流速10 L/min；干燥氣和鞘氣溫度300 ℃；母離子m/z485.2，錐孔電壓80 V，定量離子m/z441.3，碰撞能量8 eV，定性離子m/z397.3，碰撞能量18 eV。

1.5 樣品前處理

稱取浸泡粉碎后的試樣5.00 g于塑料離心管中，加入10 mL 1%氨水—甲醇溶液，渦旋振蕩10 min，5 000 r/min離心10 min，吸取上清液2 mL于預先加有500 mg無水硫酸鎂和50 mg C18吸附劑的離心管中，渦旋1 min，5 000 r/min離心2 min，取上層清液過膜，待測。

1.6 方法學評價

1.6.1 基質(zhì)效應 采用基質(zhì)標準曲線和純?nèi)軇藴是€，并按式(1)計算基質(zhì)效應(ME)。

ME=[(k1/k2)-1]×100%，

(1)

式中：

ME——基質(zhì)效應，%；

k1——基質(zhì)匹配標準曲線斜率；

k2——純?nèi)軇藴是€斜率。

通常ME>0%為基質(zhì)增強效應；ME<0%為基質(zhì)抑制效應。當|ME|≤10%時，可忽略不計；當|ME|為10%～20%時，存在較弱的基質(zhì)效應；當|ME|>20%時，存在強基質(zhì)效應[21]。

1.6.2 檢出限及定量限 通過在陰性樣品中添加標準溶液來考察方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。

1.6.3 回收率及精密度 選取陰性樣品進行加標回收試驗，添加水平分別為2，4，10 μg/kg，每個水平重復6次，計算回收率和精密度。

1.6.4 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行處理，使用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

米酵菌酸結(jié)構(gòu)式中含有3個羧基(—COOH)，酸性較強，當采用乙腈—水作為流動相時，其峰形、響應值和分類效果均優(yōu)于甲醇—水。當在水相中加入2 mmol/L乙酸銨時，其峰形得到明顯改善，因此，選擇乙腈—0.1%甲酸(含2 mmol/L乙酸銨溶液)作為流動相，采用梯度條件洗脫。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用接雙通的方式，用100 μg/L的標準溶液進樣優(yōu)化分析，在負離子模式下使用一級全掃描得m/z為485.2的準分子離子([M-H]-)，通過優(yōu)化錐孔電壓進行二級質(zhì)譜分析，得到m/z為397.3，441.3的特征碎片離子。

2.3 前處理條件優(yōu)化

2.3.1 提取 選擇乙腈、0.1%甲酸—乙腈、1%氨水—乙腈、甲醇、0.1%甲酸—甲醇和1%氨水—甲醇作為提取溶劑，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當使用1%氨水—乙腈作提取溶劑時，米酵菌酸提取效率為34.9%，明顯低于其他幾種溶劑；當使用乙腈、0.1%甲酸—乙腈、甲醇和0.1%甲酸—甲醇作提取溶劑時，其提取效率相差較小，均<70%；當使用1%氨水—甲醇作提取溶劑時，其提取效率為87.6%，高于其他幾種提取溶劑，且滿足要求。故選用1%氨水—甲醇作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑對米酵菌酸回收率的影響Figure 2 Effects of different extraction solvents on the recovery of bongkrekic acid (n=3)

2.3.2 凈化 選擇C18吸附劑、PSA吸附劑、GCB吸附劑和Oasis PRiME HLB小柱進行考察，結(jié)果見圖3(a)。由圖3(a)可知，使用PSA和GCB吸附劑作凈化材料時，目標物的吸附較多，回收率<20%；使用C18吸附劑和Oasis PRiME HLB小柱時，回收率均滿足要求，但C18吸附劑的回收率略優(yōu)于Oasis PRiME HLB小柱，且雜質(zhì)干擾、基線噪聲等優(yōu)于Oasis PRiME HLB小柱。由圖3(b)可知，使用50 mg C18吸附劑的回收率優(yōu)于其他兩種。因此，選擇50 mg C18吸附劑作為凈化方法。

圖3 凈化方法及C18吸附劑用量對回收率的影響Figure 3 Effects of different purification methods and the amount of C18 adsorbent dosage on recovery (n=3)

2.4 方法學評價

2.4.1 基質(zhì)效應 由表1可知，基質(zhì)效應為21.8%，說明米酵菌酸在木耳基質(zhì)中存在較強的基質(zhì)增強效應，為減弱或消除基質(zhì)效應對結(jié)果的影響，采用基質(zhì)匹配標準曲線進行定量分析。

2.4.2 方法的標準曲線和檢出限 由表1可知，米酵菌酸在0.50～10.00 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)(r)為0.998 3，線性關(guān)系良好，檢出限為2.0 μg/kg。

表1 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及基質(zhì)效應Table 1 Linear range, Linear equation, correlation coefficient (r), limits of detection (LOD) and matrix effects (ME) of bongkrekic acid

2.4.3 回收率及精密度 由表2可知，3個添加水平的日內(nèi)平均回收率為74.4%～91.6%，日內(nèi)相對標準偏差(RSD)為6.0%～9.2%；日間平均回收率為74.9%～89.4%，日間相對標準偏差(RSD)為3.3%～4.3%。說明試驗方法具有較好的重復性與準確性，可用于木耳中米酵菌酸殘留量的定性、定量分析。

表2 加標回收率和精密度Table 2 Recoveries of standard addition and precisions of bongkrekic acid

標準溶液、空白樣品及加標樣品的總離子流圖如圖4所示。

圖4 米酵菌酸標準溶液、黑木耳空白樣品、黑木耳 加標樣品總離子流圖Figure 4 TIC chromatograms of standard solution, blank sample of auricularia auricula and bongkrekic acid spiked sample of auricularia auricular

2.5 樣品測定

按試驗建立的方法對浸泡48 h后的10批次黑木耳進行測定，每個樣品平行測定2次，結(jié)果均未檢出米酵菌酸。由于試驗是在冬季進行的，故未能反映不同季節(jié)環(huán)境條件對黑木耳浸泡的影響。

3 結(jié)論

建立了QuECHERS結(jié)合UHPLC-MS/MS法快速測定木耳中米酵菌酸殘留量的檢測方法，并對建立的方法進行方法學驗證。結(jié)果表明，試驗方法前處理簡單、快速、靈敏度、精密度和分析準確性均滿足相關(guān)要求，且方法檢出限低于現(xiàn)有檢測標準，單個樣品分析時間為4 min，能夠快速、準確定性和定量分析木耳中米酵菌酸殘留量，為日常監(jiān)管提供技術(shù)支持。后續(xù)可研究黑木耳中產(chǎn)生米酵菌酸與浸泡時環(huán)境條件的關(guān)系，以揭示米酵菌酸在浸泡過程中的產(chǎn)生機理。