劉 軍 吳 剛 黃 瑋

(1 廣西柳州市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，柳州市 545000，電子郵箱：305302887@qq.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南寧市 530021)

神經(jīng)系統(tǒng)疾病特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是多因多果的復(fù)雜疾病，近年來其發(fā)病率逐漸升高，備受關(guān)注[1-2]。家系研究表明，有家族史的人群發(fā)生腦血管疾病的風(fēng)險顯著增高[3]；同卵雙生子同時發(fā)生腦卒中的概率是異卵雙生子的5倍[4]。這提示遺傳因素在腦血管疾病的發(fā)生中具有重要作用。大量基因組學(xué)研究表明，北高加索人群和亞洲人群在腦梗死的遺傳易感性方面存在顯著差異[5-7]，但在腦出血易感基因方面的研究證據(jù)還不足。目前認(rèn)為，載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因多態(tài)性在蛛網(wǎng)膜下腔出血的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。但由于實(shí)驗設(shè)計方法不同，樣本量大小不一，結(jié)論仍然備受爭議。為了闡明ApoE基因多態(tài)性與腦出血之間的關(guān)系，以及北高加索人群與亞洲人群之間該基因多態(tài)性的差異，本研究擬通過對已發(fā)表的ApoE基因多態(tài)性與蛛網(wǎng)膜下腔出血的相關(guān)研究進(jìn)行Meta分析，以期獲得較為客觀的結(jié)論。

1 材料與方法

1.1 檢索策略 以subarachnoid hemorrhage、apolipoprotein E、APOE、polymorphism、mutation、variant為英文檢索詞，組合檢索PubMed、Web of Science、Embase和Cochrane Library數(shù)據(jù)庫。以“蛛網(wǎng)膜下腔出血”“載脂蛋白E”和“多態(tài)性”為中文檢索詞，組合檢索中國知網(wǎng)(China National Knowledge Infrastructure，CNKI)和萬方數(shù)據(jù)庫。檢索時間為1990年1月1日至2019年2月20日。文種語言僅限于中文和英文。同時手工檢索納入文獻(xiàn)的參考文獻(xiàn)。

1.2 文獻(xiàn)的納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)文獻(xiàn)的研究類型為病例對照研究；(2)文獻(xiàn)研究對象分為病例組和對照組，病例組為明確診斷為蛛網(wǎng)膜下腔出血的患者，對照組為正常人群；(3)暴露因素為ApoE基因多態(tài)性；(4)結(jié)局指標(biāo)為蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)病風(fēng)險。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)，只納入最近的1篇；(2)未提供基因型分布情況和主要結(jié)局等數(shù)據(jù)；(3)病例組或?qū)φ战M樣本數(shù)較少(<30例)；(4)遺傳家系；(5)學(xué)位論文、會議摘要、綜述，動物實(shí)驗等；(6)非中文或英文文獻(xiàn)；(7)基因型分布頻率不符合哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)定律。

1.3 文獻(xiàn)篩選和偏倚風(fēng)險評價 由2名文獻(xiàn)評價員獨(dú)立篩選文獻(xiàn)、提取資料并進(jìn)行核對，然后使用紐卡斯?fàn)?渥太華量表(Newcastle-Ottawa Scale,NOS)[8]對納入的文獻(xiàn)進(jìn)行偏倚風(fēng)險評價，任一步驟意見不統(tǒng)一時均討論解決。NOS評分≥6分視為納入文獻(xiàn)的質(zhì)量較好。

1.4 數(shù)據(jù)提取 資料提取的內(nèi)容包括發(fā)表時間、作者、研究實(shí)施的國家、人群，病例組和對照組的樣本量，ApoE基因各等位基因和基因型分布頻率等。ApoE基因是由3個等位基因(ε2、ε3、ε4)構(gòu)成，共有6種基因型(ε2/2、ε2/3、ε2/4、ε3/3、ε3/4、ε4/4)，其中ε3/3為野生型，ε2/2、ε4/4為純合突變型，ε2/3、ε2/4、ε3/4為雜合突變。本文以ε3(ε3/3)為參考，運(yùn)用以下8個模型分析ApoE基因ε2、ε4等位基因多態(tài)性與蛛網(wǎng)膜下腔出血易感性的關(guān)系。(1)ε2顯性模型(ε2/2+ε2/3+ε2/4和ε3/3)；(2)ε2等位基因模型(ε2和ε3)； (3)ε4顯性模型(ε2/4+ε3/4+ε4/4和ε3/3)；(4)ε4等位基因模型(ε4和ε3)；(5)ε2/2純合子模型(ε2/2和ε3/3)； (6)ε4/4純合子模型(ε4/4和ε3/3)；(7)ε2隱性模型(ε2/2和ε2/3+ε2/4+ε3/3)；(8)ε4隱性模型(ε4/4和ε2/4+ε3/4+ε3/3)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用比值比(odds ratio,OR)及其95%CI評價ApoE基因多態(tài)性與蛛網(wǎng)膜下腔出血易感性的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。對納入文獻(xiàn)的對照組基因型分布頻率進(jìn)行χ2檢驗，判斷其是否符合HWE定律，P>0.05則認(rèn)為符合HWE定律，說明樣本具有群體代表性。采用Q檢驗和I2檢驗分析各研究之間的異質(zhì)性：若P>0.1或I2≤50%，說明各研究之間沒有明顯異質(zhì)性，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；反之則采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；采用敏感性分析評估合并結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。采用Egger直線回歸法檢驗發(fā)表偏倚，若P>0.05，提示發(fā)表偏倚不顯著，并繪制漏斗圖。使用R軟件的GWASExact HW程序包計算[9]HWE，通過Review Manager 5.3建立森林圖，采用Stata 15.0軟件進(jìn)行其余的分析。Meta分析的結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果 共檢索到相關(guān)文獻(xiàn)218篇，經(jīng)過納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)逐層篩選，最終納入7篇文獻(xiàn)[10-16](Fayed等[17]的研究因納入樣本數(shù)太少被排除，Kokubo等[18]和Suvatha等[19]的研究因不滿足HWE定律被排除)。檢索和篩選流程見圖1。

圖1 文獻(xiàn)檢索和篩選流程圖

2.2 納入研究的基本特征及偏倚風(fēng)險評價結(jié)果 納入的7篇文獻(xiàn)中有4篇[10，13-15]對北高加索人群進(jìn)行分析，有3篇[11-12，16]對亞洲人群進(jìn)行分析；納入分析的病例組852例，對照組1 420例。χ2檢驗結(jié)果均顯示P>0.05 ，提示基因型分布頻率均符合HWE定律。偏倚風(fēng)險評價結(jié)果示，1篇文獻(xiàn)的NOS評分為6分[10]，2篇的NOS評分為7分[11-12]，其余4篇文獻(xiàn)的NOS評分為8分[13-16]，提示納入文獻(xiàn)的質(zhì)量較好。納入研究的基本特征及偏倚風(fēng)險評價結(jié)果見表1。

表1 納入研究的基本特征及偏倚風(fēng)險評價結(jié)果

2.3 ε2顯性模型分析結(jié)果 7篇文獻(xiàn)[10-16]均分析了ε2顯性模型，各研究之間不存在明顯的異質(zhì)性(I2=37%，P=0.14)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；結(jié)果顯示，ε2顯性模型沒有增加蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=1.07，95%CI：0.83,1.37；P=0.60)。亞組分析結(jié)果顯示，ε2顯性模型對亞洲人群及北高加索人群蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性均無顯著影響(均P>0.05)。漏斗圖基本對稱，Egger檢驗結(jié)果顯示P=0.504，提示沒有明顯的發(fā)表偏倚。敏感性分析提示結(jié)果可靠。見圖2。

圖2 ε2顯性模型分析結(jié)果

2.4 ε4顯性模型分析結(jié)果 7篇文獻(xiàn)[10-16]均分析了ε4顯性模型，各研究之間不存在明顯的異質(zhì)性(I2=29%，P=0.21)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；結(jié)果顯示，ε4顯性模型沒有增加蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=1.03，95%CI：0.83，1.28；P=0.79)。亞組分析結(jié)果顯示，ε4顯性模型對亞洲人群與北高加索人群蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性均無顯著影響(均P>0.05)。漏斗圖基本對稱，Egger檢驗結(jié)果顯示P=0.702，提示納入的研究沒有明顯的發(fā)表偏倚。敏感性分析提示結(jié)果可靠。見圖3。

圖3 ε4顯性模型分析結(jié)果

2.5 ε2等位基因模型分析結(jié)果 7篇文獻(xiàn)[10-16]均分析了ε2等位基因模型，各研究之間不存在明顯的異質(zhì)性(I2=42%，P=0.11)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；結(jié)果顯示，與ε3等位基因相比，ε2等位基因沒有增加蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=1.10,95%CI:0.88，1.38；P=0.41)。亞組分析結(jié)果顯示，ε2等位基因模型對亞洲人群與北高加索人蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性均無顯著影響(均P>0.05)。漏斗圖基本對稱，Egger檢驗結(jié)果顯示P=0.237，提示沒有明顯的發(fā)表偏倚。敏感性分析提示結(jié)果可靠。見圖4。

圖4 ε2等位基因模型分析結(jié)果

2.6 ε4等位基因模型分析結(jié)果 7篇文獻(xiàn)[10-16]均分析了ε4等位基因模型，各研究之間不存在明顯的異質(zhì)性(I2=40%，P=0.12)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析，結(jié)果顯示，與ε3等位基因相比，ε4等位基因沒有增加蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=1.04，95%CI：0.86，1.25；P=0.71)。亞組分析結(jié)果顯示，ε4等位基因模型對亞洲人群與北高加索人蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性均無顯著影響(均P>0.05)。漏斗圖基本對稱，Egger檢驗結(jié)果顯示P=0.697，提示沒有明顯的發(fā)表偏倚。敏感性分析提示結(jié)果可靠。見圖5。

圖5 ε4 等位基因模型分析結(jié)果

2.7 ε2/2純合子模型分析結(jié)果 7篇文獻(xiàn)[10-16]均分析了ε2/2純合子模型，各研究之間不存在明顯的異質(zhì)性(I2=0%，P=0.44)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；結(jié)果顯示以ε3/3基因型為對照，ε2純合子突變沒有增加蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=1.74，95%CI：0.76，3.97；P=0.19)。亞組分析結(jié)果顯示，ε2/2 純合子突變增加了北高加索人蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=3.27，95%CI：1.08，9.88；P=0.04)，而對亞洲人群蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性無顯著影響(OR=0.72，95%CI：0.18，2.80；P=0.63)。漏斗圖基本對稱，Egger檢驗結(jié)果顯示P=0.504，提示各研究沒有明顯的發(fā)表偏倚。敏感性分析結(jié)果提示，移除文獻(xiàn)[13]后對分析結(jié)果影響較大，結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。見圖6。

圖6 ε2/2純合子模型分析結(jié)果

2.8 ε4/4純合子模型分析結(jié)果 7篇文獻(xiàn)[10-16]均分析了ε4/4純合子模型，各研究之間不存在明顯的異質(zhì)性(I2=0%，P=0.71)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；結(jié)果顯示，以ε3/3為對照，ε4/4純合子突變沒有增加蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=1.00,95%CI：0.52，1.92；P=0.99)。亞組分析結(jié)果顯示，ε4/4純合子突變模型對亞洲人群和北高加索人群蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性無顯著影響(均P>0.05)。漏斗圖基本對稱，Egger檢驗結(jié)果顯示P=0.504，提示沒有明顯的發(fā)表偏倚。敏感性分析提示結(jié)果可靠。見圖7。

圖7 ε4/4純合子模型分析結(jié)果

2.9 ε2 隱性模型分析結(jié)果 7篇文獻(xiàn)[10-16]均分析了ε2隱性模型，各研究之間不存在明顯的異質(zhì)性(I2=0%，P=0.43)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；結(jié)果顯示：ε2 隱性模型沒有增加蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=1.73，95%CI：0.76，3.95；P=0.19)。亞組分析結(jié)果顯示，ε2 隱性模型增加了北高加索人蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=3.37，95%CI：1.12，10.19；P=0.03)，而對亞洲人群無顯著影響(OR=0.69，95%CI：0.18，2.69；P=0.60)。漏斗圖基本對稱，Egger檢驗分析結(jié)果顯示P=0.213，提示沒有明顯的發(fā)表偏倚。敏感性分析結(jié)果提示移除文獻(xiàn)[13]后對分析結(jié)果影響較大，結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。見圖8。

圖8 ε2 隱性模型分析結(jié)果

2.10 ε4 隱性模型分析結(jié)果 7篇文獻(xiàn)[10-16]均分析了ε4隱性模型，各研究之間不存在明顯的異質(zhì)性(I2=0%，P=0.79)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；結(jié)果顯示，ε4隱性模型沒有增加蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=0.98，95%CI：0.51，1.89；P=0.96)。亞組分析結(jié)果顯示，ε4隱性模型對亞洲人群與北高加索人群蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性無顯著影響(均P>0.05)。漏斗圖基本對稱，Egger檢驗分析結(jié)果顯示P=0.615，提示沒有明顯的發(fā)表偏倚。敏感性分析提示結(jié)果可靠。見圖9。

圖9 ε4 隱性模型分析結(jié)果

3 討 論

ApoE基因位于人類基因的第19號染色體上，全長3.7 kb，含有4個外顯子。ApoE基因突變較為常見[20]。ApoE ε2等位基因的112位點(diǎn)和158位點(diǎn)均是半胱氨酸，ApoE ε3等位基因的112位點(diǎn)是半胱氨酸，而158位點(diǎn)是精氨酸，ApoE ε4等位基因的112位點(diǎn)和158位點(diǎn)均是精氨酸。因此，ApoE等位基因分布頻率不同決定了不同人群中ApoE基因表型的差異。研究表明，ApoE基因的多態(tài)性與顱內(nèi)出血有一定的相關(guān)性，但顱內(nèi)不同部位的出血可能存在差異[12]。其中最值得關(guān)注的是ApoE ε4等位基因。研究顯示，腦葉的出血多與攜帶ApoE ε4等位基因及血管內(nèi)β淀粉樣蛋白酶沉積有關(guān)[21-22]。一項針對基因多態(tài)性與腦出血之間相關(guān)性的Meta分析結(jié)果提示，攜帶ApoE ε4等位基因與腦出血之間存在關(guān)聯(lián)，而攜帶ApoE ε2等位基因與腦出血之間并無相關(guān)性[23]。Maxwell等[24]的Meta分析結(jié)果顯示，ApoE ε4等位基因與腦葉微出血(腦實(shí)質(zhì)內(nèi)部出血)的相關(guān)程度較高，同時ApoE ε4等位基因與血管淀粉樣變相關(guān)，由此推測腦葉微出血可以作為血管淀粉樣變所致腦出血的標(biāo)志。然而，與腦葉出血不同的是，80%的蛛網(wǎng)膜下腔出血是由于顱內(nèi)動脈瘤破裂所致[25]。這或為本研究中ApoE ε4等位基因突變并沒有增加北高加索人和亞洲人蛛網(wǎng)膜下腔出血易感性的原因之一。本研究結(jié)果顯示，ApoE基因的ε2純合子突變增加了北高加索人蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性，而對亞洲人群無顯著影響；ApoE ε2隱性模型也增加了北高加索人群蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性，而對亞洲人群蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性無顯著影響。這提示ApoE ε2純合子突變和隱性模型對北高加索人群和亞洲人群蛛網(wǎng)膜下腔出血易感性的影響存在差異。同時，這一結(jié)果也提示，除了ApoE基因之外，不同人群之間蛛網(wǎng)膜下腔出血相關(guān)基因可能存在差異，這或與環(huán)境因素有關(guān)。然而，傳統(tǒng)的遺傳關(guān)聯(lián)研究，往往只能發(fā)現(xiàn)常見變異的相關(guān)位點(diǎn)，而不能進(jìn)一步探索未知的位點(diǎn)。這可能會遺漏有陽性關(guān)聯(lián)甚至效應(yīng)較大的未知基因位點(diǎn)。隨著全基因組測序等高通量基因分型平臺的建立及國際人類基因圖譜的完成，全基因組關(guān)聯(lián)分析越來越受到科學(xué)家的關(guān)注，將來可能會發(fā)現(xiàn)更多的腦出血相關(guān)基因位點(diǎn)。

本研究采用Meta分析的統(tǒng)計學(xué)方法，制定了嚴(yán)格的文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，將ApoE基因多態(tài)性與蛛網(wǎng)膜下腔出血的相關(guān)研究進(jìn)行了系統(tǒng)評價和量化。結(jié)果顯示，本研究納入文獻(xiàn)的基因型分布頻率均符合HWE定律，提示研究人群具有代表性，結(jié)果可靠。此外，本研究應(yīng)用固定效應(yīng)模型進(jìn)行總體效應(yīng)值的估計，經(jīng)Egger直線回歸和漏斗圖檢驗發(fā)表偏倚，結(jié)果均提示各研究間不存在發(fā)表偏倚，因而判斷結(jié)果較準(zhǔn)確。但本研究方法也存在一定的不足：首先，納入Meta分析的研究樣本量比較有限，證據(jù)強(qiáng)度稍低；其次，納入分析的研究大多數(shù)為原始研究，均沒有對蛛網(wǎng)膜下腔出血的解剖學(xué)因素進(jìn)行篩選，因此可能無法完全排除血管畸形等血管結(jié)構(gòu)異常所致的出血性患者。

綜上所述，ApoE基因的ε2純合子突變和隱性模型與北高加索人群蛛網(wǎng)膜下腔出血易感性相關(guān)，但對亞洲人群蛛網(wǎng)膜下腔易感性無明顯影響。應(yīng)注意識別不同人群間ApoE基因的突變情況，預(yù)測蛛網(wǎng)膜下腔出血，并給予早期干預(yù)提供科學(xué)依據(jù)。