郭志強 李鈺艷 李洪亮 張 敏 何 勇 許斌兵

(四川省遂寧市中心醫(yī)院1 麻醉科，2 內(nèi)分泌科，遂寧市 629000，電子郵箱：guozhiqiang384@163.com)

氧化應(yīng)激與心力衰竭、心律失常和心肌梗死等疾病密切相關(guān)，其過度激活容易導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生[1]?；钚匝醮厥且唤M活性小分子，在調(diào)節(jié)細胞的各種功能和生物過程中發(fā)揮著重要作用，對心血管的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，但活性氧簇的失衡會造成心血管損傷，多種心腦血管疾病的發(fā)生都與氧化應(yīng)激有關(guān)，而心血管疾病是導(dǎo)致死亡的主要疾病[2-3]。因此，從氧化應(yīng)激方面開展心血管疾病的防治研究，成為近年來的新趨勢。在臨床上丙泊酚常作為快速短效的靜脈麻醉藥，除催眠與鎮(zhèn)靜作用外，其還具有降低動脈血壓、抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡、改善細胞能量代謝障礙等功能[4-5]。研究表明，丙泊酚具有抗心肌細胞氧化損傷的作用，能夠降低心肌細胞中的活性氧簇含量，減少氧化應(yīng)激條件下心肌細胞的凋亡[6]。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號通路與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，而丙泊酚能夠通過激活PI3K/Akt信號通路減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，從而抑制腎缺血再灌注損傷，以及改善蛛網(wǎng)膜下腔出血引起的早期腦損傷[7-8]。本研究探討丙泊酚對過氧化氫誘導(dǎo)的大鼠肝Kupffer細胞氧化應(yīng)激損傷和PI3K/Akt通路的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：10只SD大鼠，10～12周齡，雌雄均可，體重260～300 g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[許可證號SCXK(渝)2019-0003]，于本院動物房常規(guī)飼養(yǎng)，環(huán)境溫度22 ℃～24 ℃，相對濕度50%，12 h光照/12 h黑暗交替，自由飲水進食。本研究符合國家實驗動物倫理保護標準及相關(guān)法律規(guī)定。

1.1.2 主要試劑和儀器：丙泊酚注射液購自四川國瑞藥業(yè)責(zé)任有限公司(規(guī)格10 mL ∶0.1 g，批號：20190815)；含10%胎牛血清的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司(批號：17502-048)；30%過氧化氫溶液、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、MTT、結(jié)合緩沖液和兔抗鼠β-actin單克隆抗體均購自美國Sigma公司(批號：SD0617M、SL5519K、SD3019、SD7123、SD5413K)；蛋白提取試劑盒、ECL顯色試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物科技有限公司(批號：hz-3101-1、hz-5102-3、hz-4105-6)；膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自嘉美生物技術(shù)有限公司(批號：s112)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒、活性氧簇檢測試劑盒、過氧化氫酶(catalase，CAT)檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號： SC0191-25、S0033M、S0101M)；96孔培養(yǎng)板購自上海生工生物工程有限公司(批號：F603204)；二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司(批號：R21250)兔抗鼠PI3K、Akt、磷酸化PI3K(phosphorylated PI3K，p-PI3K)和磷酸化Akt(phosphorylated Akt，p-Akt)單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗均購自美國Abcam公司(批號：ab01364、ab50113、ab56189、ab70142、ab0019)；SpectraMax iD5型多功能酶標儀購自上海美谷分子儀器有限公司；VersaDoc 3000型蛋白凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；CKX41型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；FACSCanto型流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Kupffer細胞的分離與培養(yǎng):參照相關(guān)文獻[9]的方法，使用梯度離心結(jié)合選擇性貼壁法分離大鼠Kupffer細胞。使用0.3%的戊巴比妥鈉以30 mg/kg的劑量進行腹腔注射，麻醉大鼠后固定、消毒，于腹部做十字切口，經(jīng)腹主動脈推注肝素(100 U/kg)，結(jié)扎下腔靜脈；切開胸腔并夾閉主動脈，剪開心臟，使血液流入胸腔，灌注不含鈣離子的Hank′s液，使肝臟逐漸變成黃白色；仔細分離切取肝臟，于無菌操作臺上使用不含鈣離子的Hank′s液沖洗，然后用注射器抽取0.05%膠原蛋白酶反復(fù)灌洗肝臟，使肝臟組織松散，呈泥狀；剝離肝包膜，經(jīng)200目網(wǎng)過濾，除去未消化的組織，得到肝細胞懸液。將肝細胞懸液在4 ℃下1 000 r/min離心3 min，取上清；然后4 ℃下10 000 r/min離心5 min，取沉淀；使用不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，同時加入1.065 g/mL細胞分離液，在4 ℃下10 000 r/min離心15 min，取沉淀；再次使用不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，在4 ℃下1 000 r/min離心5 min，取沉淀。加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，同時使用倒置相差顯微鏡鑒定Kupffer細胞，若細胞折光性強、呈圓形、體積小，15min后開始貼壁、細胞呈扁圓形、變薄、邊界模糊，4 h后大部分貼壁、胞膜伸展、體積增大、形狀不規(guī)則，24 h后細胞完全伸展、出現(xiàn)偽足、呈多邊形等不規(guī)則形狀，則該細胞為Kupffer細胞。對Kupffer細胞進行原代培養(yǎng)，然后使用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞并調(diào)整密度為1×106個/mL用于后續(xù)實驗。

1.2.2 氧化應(yīng)激損傷細胞模型的建立及分組處理:參照相關(guān)文獻[10-12]的方法，使用100 μmol/L過氧化氫誘導(dǎo)Kupffer細胞，建立氧化應(yīng)激損傷細胞模型。將Kupffer細胞按照2×104個/孔接種至96孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，加入100 μmol/L過氧化氫作用24 h。取正常Kupffer細胞作為對照組(用不含丙泊酚的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng))，將模型細胞隨機分為模型組(不含丙泊酚的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng))、丙泊酚低濃度組(含5 μmol/L丙泊酚的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng))、丙泊酚中濃度組(含25 μmol/L丙泊酚的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng))、丙泊酚高濃度組(含50 μmol/L 丙泊酚的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng))和陽性對照組(含0.1 μmol/L鹽酸右美托咪定的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng))。6組細胞均于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。每組均設(shè)6個平行孔。

1.2.3 MTT法檢測細胞活性:收集1.2.2中培養(yǎng)12 h后的細胞，加入10 μL的MTT繼續(xù)孵育4 h，吸取上清，加入150 μL的DMSO，充分震蕩混勻15 min后用多功能酶標儀檢測各孔570 nm處吸光度值(即OD570)。細胞活性=(實驗組OD570/對照組OD570)×100%。實驗重復(fù)6次。

1.2.4 流式細胞法檢測細胞凋亡:收集1.2.2中培養(yǎng)12 h后的細胞，1 200 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)基并收集細胞，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，每次2 min，用400 μL結(jié)合緩沖液懸浮細胞，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC染液，輕輕混勻后于2 ℃～8 ℃避光孵育15 min；加入10 μL PI后輕輕混勻，于2 ℃～8 ℃避光孵育5 min；使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，統(tǒng)計細胞凋亡率。實驗重復(fù)6次。

1.2.5 檢測細胞LDH釋放量:收集1.2.2中培養(yǎng)12 h后的細胞，嚴格按照乳酸脫氫LDH試劑盒說明書進行操作，使用多功能酶標儀測定490 nm處各孔吸光度值(即OD490)，計算LDH釋放量。LDH釋放量(%)=(培養(yǎng)液OD490+細胞勻漿OD490)/培養(yǎng)液OD490×100%。實驗重復(fù)6次。

1.2.6 檢測細胞活性氧簇含量：收集1.2.2中培養(yǎng)12 h后的細胞上清液，按照活性氧檢測試劑盒說明書進行操作，使用多功能酶標儀測量各孔的熒光強度，即調(diào)整最佳激發(fā)波長為488 nm、最佳發(fā)射波長為525 nm時顯示的熒光強度，以細胞培養(yǎng)基的上清液作為空白組。活性氧簇含量=(實驗組熒光強度-空白組熒光強度)/(對照組熒光強度-空白組熒光強度)×100%。實驗重復(fù)6次。

1.2.7 檢測CAT活性：收集1.2.2中培養(yǎng)12 h后的細胞上清液，按照CAT檢測試劑盒說明書進行操作。以25 ℃反應(yīng)1 minOD240減少0.1的CAT量為1個CAT酶活單位，計算CAT活性。CAT活性(U/mg)=(ΔOD240×VT)/(0.1×VS×t×W)，其中，ΔOD240代表反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化，VT代表提取酶液總體積(mL)，W代表樣品重量(mg)，t代表反應(yīng)時間(min)，VS代表測定時所取酶液體積(mL)。實驗重復(fù)6次。

1.2.8 Western blot檢測PI3K、Akt的磷酸化水平：收集1.2.2中培養(yǎng)12 h后的細胞，使用蛋白提取試劑盒提取細胞中的總蛋白。使用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，將1 ∶500濃度稀釋后的兔抗鼠PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt和β-actin一抗4 ℃過夜孵育，以辣根過氧化物酶標注的羊抗鼠IgG二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，用ECL顯色試劑盒顯色，凝膠成像儀拍照，分析灰度值，以β-actin為參照進行半定量分析，PI3K、Akt磷酸化水平分別以p-PI3K/PI3K比值、p-Akt/Akt比值表示。實驗重復(fù)6次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組Kupffer細胞活性的比較 與對照組相比，模型組Kupffer細胞活性降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、丙泊酚低濃度組和丙泊酚中濃度組Kupffer細胞活性升高(均P<0.05)，而丙泊酚高濃度組Kupffer細胞活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與陽性對照組、丙泊酚低濃度組和丙泊酚中濃度組比較，丙泊酚高濃度組Kupffer細胞活性降低(均P<0.05)；陽性對照組、丙泊酚低濃度組和丙泊酚中濃度組Kupffer細胞活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組Kupffer細胞活性的比較(x±s，%)

2.2 各組Kupffer細胞凋亡率的比較 與對照組相比，模型組Kupffer細胞凋亡率升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、丙泊酚低濃度組和丙泊酚中濃度組Kupffer細胞凋亡率降低(均P<0.05)，而丙泊酚高濃度組Kupffer細胞凋亡率升高(P<0.05)；與陽性對照組相比，丙泊酚低濃度組和丙泊酚中濃度組Kupffer細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，丙泊酚高濃度組Kupffer細胞凋亡率升高(P<0.05)；丙泊酚中濃度組、丙泊酚低濃度組、丙泊酚高濃度組Kupffer細胞凋亡率依次升高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組Kupffer細胞凋亡率的比較(x±s，%)

2.3 各組Kupffer細胞LDH釋放量、活性氧簇含量及CAT活性的比較 與對照組相比，模型組Kupffer細胞LDH釋放量和活性氧簇含量升高，CAT活性降低(均P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、丙泊酚低濃度組和丙泊酚中濃度組Kupffer細胞LDH釋放量和活性氧簇含量降低，CAT活性升高(均P<0.05)，而丙泊酚高濃度組Kupffer細胞LDH釋放量和活性氧簇含量升高，CAT活性降低(均P<0.05)；與陽性對照組比較，丙泊酚低濃度組Kupffer細胞LDH釋放量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，活性氧簇含量升高、CAT活性降低(均P<0.05)，丙泊酚中濃度組Kupffer細胞LDH釋放量、活性氧簇含量、CAT活性差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，丙泊酚高濃度組Kupffer細胞LDH釋放量和活性氧簇含量升高、CAT活性降低(均P<0.05)；與丙泊酚低濃度組相比，丙泊酚中濃度組Kupffer細胞LDH釋放量和CAT活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，活性氧簇含量降低(P<0.05)，丙泊酚高濃度組Kupffer細胞LDH釋放量和活性氧簇含量升高，CAT活性降低(均P<0.05)；與丙泊酚中濃度組相比，丙泊酚高濃度組Kupffer細胞LDH釋放量和活性氧簇含量升高，CAT活性降低(均P<0.05)。見表3。

表3 各組Kupffer細胞LDH釋放量、活性氧簇含量及CAT活性的比較(x±s)

2.4 各組Kupffer細胞PI3K和Akt磷酸化水平的比較 與對照組相比，模型組Kupffer細胞PI3K和Akt的磷酸化水平降低(均P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、丙泊酚低濃度組和丙泊酚中濃度組Kupffer細胞PI3K和Akt的磷酸化水平升高(均P<0.05)，而丙泊酚高濃度組Kupffer細胞PI3K和Akt的磷酸化水平降低(均P<0.05)；與陽性對照組、丙泊酚低濃度組和丙泊酚中濃度組相比，丙泊酚高濃度組Kupffer細胞PI3K和Akt的磷酸化水平降低(均P<0.05)；陽性對照組、丙泊酚低濃度組和丙泊酚中濃度組Kupffer細胞PI3K和Akt的磷酸化水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表4和圖1。

表4 各組Kupffer細胞PI3K和Akt磷酸化水平的比較(x±s)

圖1 蛋白條帶圖

3 討 論

氧化應(yīng)激損傷與心血管疾病的發(fā)生存在密切的關(guān)系：氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致活性氧簇含量增多，耗盡抗氧化酶，使自由基損害心血管，導(dǎo)致心血管細胞線粒體內(nèi)電子傳遞鏈受影響，引起線粒體功能障礙，誘導(dǎo)細胞凋亡[13]。因此，減少氧化應(yīng)激逐漸成為治療心血管疾病的重要研究方向，但是，目前并沒有特定的抗氧化治療方法來預(yù)防或治療心血管疾病。

當(dāng)離體細胞受到損傷時，LDH會由細胞釋放至培養(yǎng)液中，所以可用LDH釋放量來評估細胞受損程度。另外，活性氧簇過量會產(chǎn)生大量自由基，損害細胞，誘導(dǎo)細胞凋亡。丙泊酚是臨床常用的靜脈麻醉劑，可清除自由基，具有顯著的抗氧化作用[5]。Yu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚能夠通過減少腦缺血再灌注損傷過程中琥珀酸鹽的積累來防止氧化應(yīng)激的發(fā)生。Guo等[15]研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可在臨時載瘤動脈夾閉手術(shù)后7 d內(nèi)防止大腦發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，從而保護神經(jīng)，促進認知功能的恢復(fù)。Yoon等[16]研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚能夠誘導(dǎo)細胞自噬來減少氧化應(yīng)激損傷所致的COS-7細胞凋亡。丙泊酚作為一種臨床使用的靜脈麻醉藥，高濃度易對人體造成損害。本研究使用過氧化氫干預(yù)Kupffer細胞后，細胞活性降低，凋亡率升高，LDH釋放量和活性氧簇含量增加，CAT活性降低，提示成功建立氧化應(yīng)激損傷細胞模型。本研究結(jié)果顯示，低、中濃度的丙泊酚均可抑制LDH的釋放，提高活性氧簇的清除能力和CAT活性，增強細胞活性，減少細胞凋亡，但高濃度丙泊酚(50 μmol/L)卻加重過氧化氫誘導(dǎo)的Kupffer細胞氧化應(yīng)激損傷。這提示中、低濃度丙泊酚可通過增強細胞CAT活性，提高細胞清除活性氧的能力，減少LDH的釋放，從而發(fā)揮其抵抗氧化應(yīng)激損傷的作用，以維持細胞活性、減少細胞凋亡，但其作用機制仍需進一步研究。

氧化應(yīng)激與PI3K/Akt信號通路密切相關(guān)，PI3K是一種胞外的磷脂酰肌醇激酶，PI3K活化后可誘導(dǎo)Akt磷酸化，p-Akt進一步活化下游信號因子，調(diào)節(jié)細胞活性，抑制細胞凋亡[7]。楊莎莎等[17]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過激活PI3K/Akt通路抑制高糖致腎小管上皮細胞凋亡；Lim等[18]研究發(fā)現(xiàn)，抗衰老蛋白能夠通過負調(diào)控PI3K/Akt信號通路，提高抗氧化物酶活性，從而保護他克莫司誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激；Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，氫氣通過PI3K/Akt信號通路抑制核因子E2相關(guān)因子2的激活，從而保護細胞免受紫外線輻射誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷；Zhao等[20]研究發(fā)現(xiàn)，芪藶強心膠囊可能通過PI3K/Akt信號通路來減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。上述研究表明，PI3K/Akt通路與細胞的氧化應(yīng)激損傷及細胞凋亡密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，低、中濃度的丙泊酚能夠提高Kupffer細胞PI3K和Akt的磷酸化水平，這提示丙泊酚可能通過激活PI3K/Akt信號通路來減輕氧化應(yīng)激損傷，抑制細胞凋亡。

綜上所述，低、中濃度(5 μmol/L、25 μmol/L)的丙泊酚可減輕過氧化氫誘導(dǎo)的Kupffer細胞氧化應(yīng)激損傷，增強細胞活性，抑制細胞凋亡，其機制可能與PI3K/Akt通路有關(guān)。